張 杰，吳 昊

安徽道源堂中藥飲片有限公司，安徽渦陽，233600

芍藥(RadixPaeoniaeAlba.)是毛茛科植物芍藥科、芍藥屬的多年生草本植物[1]。根粗壯，分枝黑褐色，為中國傳統(tǒng)中藥，主要分布于安徽、浙江、四川等地[2]。其用藥歷史悠久，現(xiàn)存最早的藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》便有收載[3]。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效[4-6]。白芍的化學(xué)成分主要為單萜及其苷類[7]、三萜類、芳香酸及其黃酮及其苷類、鞣質(zhì)類、多糖類、揮發(fā)油等[8]。有研究表明芍藥具有多種生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗抑郁和抗肝纖維化[9]等，具有保肝、抗炎、抗風(fēng)濕、調(diào)節(jié)免疫功能等藥理作用[10-14]。黃酮類成分有豐富的藥理活性，具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛作用，對心腦缺血損傷、心律失常等也有一定的保護。近年來，對芍藥的研究工作，取得了許多成果[15-16]，但對芍藥花中生物活性成分提取條件的優(yōu)化以及芍藥根中黃酮類物質(zhì)的測定缺少系統(tǒng)性研究[17]。綜上所述，本研究以HPLC檢測芍藥根中蘆丁的含量，旨在建立芍藥質(zhì)量檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，為芍藥資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采集于亳州當(dāng)?shù)胤N植的芍藥，并經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)鑒定，洗凈后干燥處理。用粉碎機粉碎，過80目篩后于磨口瓶中低溫保存。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀(SPD-20A型，日本島津儀器有限公司)，超純水機(Direct-Q3型，美國Millipore公司)，色譜柱(C-8型，日本島津儀器有限公司)，粉碎機(9FZ-360型，鄭州中遠(yuǎn)機械設(shè)備有限公司)，抽濾裝置(JC-CHL-12型，天津Do-Chrom Technology公司)，電子天平(JA2603B型，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)。

乙腈(色譜純)，上海吉至生化科技有限公司；冰乙酸(分析純)、甲醇(分析純)，天津同新化工有限公司；蘆丁(rutin)標(biāo)準(zhǔn)品，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

2 實驗方法

2.1 樣品溶液的制備

取芍藥根粉末，精確稱取5.00 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶20加入超純水，持續(xù)加熱3 h。冷卻抽濾，將所得樣品溶液過0.45 μm濾膜即得檢測樣液。

2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取蘆丁41.4 mg于試管中，加入10 mL甲醇，得到濃度為4.14 mg·mL-1的儲備液。取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1 mL定容到10 mL，過0.45 μm微孔濾膜即得濃度為414 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 色譜條件

采用shim-pack C18色譜柱，以乙腈為有機相(A),0.5%醋酸(B)為流動相，設(shè)置柱溫30℃，調(diào)整總流速為0.8 mL·min-1；檢測波長260 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 HPLC梯度洗脫時間程序

3 實驗結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 線性關(guān)系考察

取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、5 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容,制成濃度為0.020 7 mg·mL-1、0.041 4 mg·mL-1、0.082 8 mg·mL-1、0.165 6 mg·mL-1、0.207 0 mg·mL-1、0.414 0 mg·mL-1系列梯度溶液。按照“2.3”設(shè)定的色譜條件進樣20 μL，重復(fù)3次，記錄出峰時間以及峰面積(圖1)。取峰面積作縱坐標(biāo)，蘆丁濃度作橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=35 838x+169 006，相關(guān)系數(shù)R=0.998 9，線性范圍為2.07～414 μg·mL-1。結(jié)果表明,蘆丁濃度與峰面積具有良好的線性關(guān)系,見圖2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(A)和樣品(B)HPLC色譜圖

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.2 精密度試驗

取“2.2”配制的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 uL，按“2.3”設(shè)定的色譜條件進行連續(xù)重復(fù)實驗6次，測得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品峰面積，計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.45%，明顯小于2%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性

取芍藥根粉末，按照“2.1”項制備供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h分別取樣，按“2.3”項色譜條件測定重復(fù)進樣測定上述樣品6次。結(jié)果顯示,樣品中蘆丁峰面積的RSD為1.1%，明顯小于2.0%，結(jié)果顯示本方法的穩(wěn)定性較好。

3.1.4 重復(fù)性

取芍藥根粉末，按照“2.1”方法制備6份供試樣品溶液，并以“2.3”設(shè)定的實驗條件進行測定，重復(fù)6次。結(jié)果表明蘆丁峰面積的RSD為1.65%，也小于2.0%，表明本方法的重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收率

精密稱取芍藥根粉末樣品5.00 g，按照“2.1”項方法制備樣品溶液，精密加入適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，計算相應(yīng)的回收率，結(jié)果見表2。

表2 蘆丁加樣回收率

3.2 含量測定

精密稱取芍藥根粉樣品，按“2.1”項方法制備供試品溶液，進樣上述溶液20 μL記錄色譜圖統(tǒng)計峰面積(圖2B)，重復(fù)3次。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算芍藥樣品中所含蘆丁的含量，見表3。

表3 芍藥根樣品中蘆丁含量

4 討 論

芍藥作為中國傳統(tǒng)中藥，最早記載于古籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中[4]。中醫(yī)指出芍藥具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的功效。蘆丁作為芍藥中黃酮類物質(zhì)，不僅具有多種生物學(xué)活性，如調(diào)節(jié)毛細(xì)血管滲透性、降血脂、保護細(xì)胞和抗痙攣等生物學(xué)作用，而且還有多種藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒，預(yù)防和治療心血管疾病、糖尿病，同時還有抗癌、神經(jīng)保護等藥理作用[18]。本研究以傳統(tǒng)中藥煎煮方法為背景，按料液比1∶20回流提取3 h。以乙腈醋酸水為流動相，采用shim-pack C18色譜柱，設(shè)置柱溫30 ℃，調(diào)整總流速為0.8 mL·min-1；檢測波長260 nm。檢測結(jié)果表明蘆丁在芍藥根藥材中含量為8.58 μg·mL-1。對中草藥黃酮類成分研究具有重要意義。

綜上所述，本研究建立HPLC法，測定白芍中蘆丁成分的含量，初步對白芍的質(zhì)量進行考察，方法簡單，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，對白芍整體質(zhì)量控制評價體系的建立提供了實驗基礎(chǔ)。