徐楠 徐宇娟 孫盼 宗仁杰 郭敏亮

（揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens），是一種廣泛存在于土壤中的革蘭氏陰性菌。作為一種常見的植物病原菌，它能夠使大多數(shù)雙子葉植物發(fā)生冠癭瘤疾病。其致病機(jī)制是將自身Ti質(zhì)粒上的部分DNA片段（簡稱T-DNA）以T-復(fù)合物的形式轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主植物細(xì)胞，并整合到宿主的基因組中，使宿主植物細(xì)胞發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化而致病［1-3］。由于根癌農(nóng)桿菌能將基因轉(zhuǎn)給宿主植物，因此，根癌農(nóng)桿菌很快就成為了應(yīng)用最廣泛的植物轉(zhuǎn)基因工具菌［1-6］。根癌農(nóng)桿菌的致?。ɑ蜣D(zhuǎn)基因）受宿主分泌的糖類、酚類等小分子化合物的誘導(dǎo)［7-9］。當(dāng)環(huán)境中沒有誘導(dǎo)物時(shí)，絕大多數(shù)與致病有關(guān)的基因都不表達(dá)，根癌農(nóng)桿菌不具備致病能力［9］。當(dāng)誘導(dǎo)物存在時(shí)，就可以誘導(dǎo)相關(guān)的vir基因表達(dá)出一系列致毒蛋白（virulence protein），其中的VirD2蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性，從Ti質(zhì)粒上切下單鏈的T-DNA，并通過共價(jià)鍵與T-DNA的5′-端連接形成VirD2-T-DNA復(fù)合物，進(jìn)而加工成T-復(fù)合物［1-3，10-12］。T-復(fù)合物通過根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞兩端的四型分泌系統(tǒng)（type IV secretion system，T4SS）進(jìn)入植物細(xì)胞，其中VirC1蛋白和VBP（VirD2-binding protein）蛋白可以提高T4SS對T-復(fù)合物的招募作用［13-15］。

VBP蛋白，又叫T-復(fù)合物招募蛋白，是一種可以與VirD2專一性結(jié)合，并參與T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白［14］。其具體功能是將T-復(fù)合物招募到根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞膜上的T4SS處，促進(jìn)T-DNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。根癌農(nóng)桿菌基因組中含有3個(gè)能編碼VBP的平行同源基因，分別為vbp1（atu5117）、vbp2（atu4860）、vbp3（atu4856）［13-14］。只有3個(gè)vbp基因全部敲除，根癌農(nóng)桿菌的致瘤能力才大幅降低［13］，3個(gè)同源基因在招募T-復(fù)合物上具有功能互補(bǔ)性。但是，從進(jìn)化的觀點(diǎn)看，相對精簡的原核基因組為一項(xiàng)非必需功能保存3個(gè)同源基因，有些不太經(jīng)濟(jì)，因此，我們推出VBP蛋白可能還具有招募T-復(fù)合物之外的其它功能［14］。為了進(jìn)一步探尋VBP的其它功能，我們對3個(gè)vbp基因在致瘤誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)vbp1和vbp3基因的表達(dá)不受致瘤誘導(dǎo)條件的影響，而vbp2基因的表達(dá)卻受致瘤誘導(dǎo)條件的影響，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)vbp1的缺失也會影響vbp2的表達(dá)［16］。這些研究表明3個(gè)vbp基因也可能相互之間影響彼此的表達(dá)。進(jìn)一步研究vbp2基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，不僅對優(yōu)化根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)條件，提高轉(zhuǎn)基因效率具有實(shí)踐指導(dǎo)意義，而且對深入解析VBP蛋白的其它生物學(xué)功能也具有重要的參考價(jià)值。

本研究在生物信息分析vbp2啟動子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建原位替代突變株，確定了不同誘導(dǎo)條件對vbp2啟動子的調(diào)控作用，以及最適的誘導(dǎo)濃度。根據(jù)生物信息學(xué)分析預(yù)測，通過啟動子截短的方法，確定出誘導(dǎo)作用調(diào)控元件所在的區(qū)域。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 根癌農(nóng)桿菌（A. tumefaciens）C58為胭脂堿型野生菌，vbp1和vbp2缺失的根癌農(nóng)桿菌菌株為 GMI9017Δvbp2，由 C58 衍生而來［13］，大腸桿菌宿主菌為 DH5α（Escherichia coli DH5α）；自殺質(zhì)粒pEX18Km、表達(dá)載體pUCA19、pCMV6-AN-RFP（紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒），eGFP-T（綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。本文所用到的引物如表1所示。

表1 本研究所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，根癌農(nóng)桿菌用MG/L和AB蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體配方見文獻(xiàn)［13-14，16］。

1.2 方法

1.2.1 vbp2啟動子預(yù)測和分析 在HMM Database（www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/.）、Prokaryote Promoter Prediction（https：//services.healthtech.dtu.dk/.） 和TESS（http：//agave.humgen.upenn.edu/utess/tess） 網(wǎng)站對A. tumefaciens農(nóng)桿菌T-復(fù)合物招募蛋白VBP2的編碼基因vbp2上游序列中可能存在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.2 vbp2基因閱讀框被紅色熒光蛋白編碼基因rfp準(zhǔn)確替代突變體菌株的構(gòu)建 用紅色熒光蛋白編碼基因rfp準(zhǔn)確替代vbp2基因的突變體的構(gòu)建采用同源重組的方法。該方法的原理和詳細(xì)步驟參閱文獻(xiàn)［17］。以 A. tumefaciens C58基因組為模板，Q1-F、Q1-R為引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增vbp2基因翻譯起始位點(diǎn)上游526 bp的啟動子序列。以帶有紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒pCMV6-AN-RFP為模板，用引物Rfp-F、Rfp-R擴(kuò)增紅色熒光蛋白基因rfp。以前兩次PCR產(chǎn)物為模板，以Q1-F、Rfp-R為引物，利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)建vbp2上游526 bp片段+ rfp片段融合基因。以A. tumefaciens C58基因組為模板，用引物H-F和H-R擴(kuò)增出vbp2下游1 kb片段。最后利用引物Q1-F和H-R將vbp2上游526 bp片段+rfp片段與vbp2下游1 kb片段通過重疊PCR連接起來。用TaKaRa瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，回收擴(kuò)增的目的片段和用BamH I和Hind III切過的載體pEX18Km。用T4連接酶將兩者4℃過夜連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定正確后送測序，確定測序結(jié)果正確后，將所構(gòu)質(zhì)粒pEX18Km-rfp電轉(zhuǎn)至C58感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含卡那霉素抗性的MG/L固體培養(yǎng)基上進(jìn)行第一次抗性篩選。將長出的單克隆在新的卡那抗性的MG/L固體培養(yǎng)基上純化，以保證其具有卡那抗性。將純化的具有卡那抗性的單克隆劃線于含5%蔗糖的MG/L固體培養(yǎng)基上，若不長則說明賦予了蔗糖敏感性；選取同時(shí)具有卡那霉素抗性和蔗糖敏感性的轉(zhuǎn)化子，劃線于含5%蔗糖的MG/L固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行第二次篩選，此時(shí)會出現(xiàn)包括野生型和替代突變株，兩種類型的單菌落，將長出來的菌落在5%蔗糖的MG/L上純化一次，再劃線于含卡那霉素的MG/L固體培養(yǎng)基上，確認(rèn)卡那抗性和蔗糖敏感性均已丟失。挑取無卡那霉素抗性和蔗糖不敏感的單菌落進(jìn)行PCR 鑒定，鑒定成功后將產(chǎn)物送測序。

1.2.3 誘導(dǎo)物對vbp2啟動子的誘導(dǎo)及啟動子活性的測定 在取得vbp2基因閱讀框被紅色熒光蛋白編碼基因rfp準(zhǔn)確替代的突變體菌株后，vbp2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性就可以通過測定其控制的紅色熒光蛋白RFP的表達(dá)量來表征。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是用不同濃度的不同誘導(dǎo)物（乙酰丁香酮AS和鼠李糖Rha）誘導(dǎo)上述突變體菌株。如果vbp2的啟動子能被誘導(dǎo)，而表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄活性，就可以表達(dá)出不同量的紅色熒光蛋白RFP，RFP在細(xì)胞粗提液總蛋白中的占比就不同。因此，可以用細(xì)胞粗提液中單位總蛋白的熒光強(qiáng)度來表示熒光蛋白的表達(dá)量。詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟如下：將上述突變體菌株的單菌落在MG/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600= 0.5-0.7，離心收集菌體后轉(zhuǎn)移至AB蔗糖培養(yǎng)基過渡培養(yǎng)4-5 h，然后分成若干等份，不同的等份分別用不同濃度的不同誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12-16 h。AS的誘導(dǎo)濃度設(shè)為0、50、100、150、200和 250 μmol/L。Rha的誘導(dǎo)濃度設(shè)為 0、50、100、150、200 和 250 μmol/L。收集經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞，用50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.4）洗滌兩遍，重懸為總體積10 mL的菌體懸浮液，菌體懸浮液通過調(diào)整OD600一致，以保證每份經(jīng)誘導(dǎo)的菌體懸浮液具有相同的細(xì)胞量。用超聲波（220 W，3 s on/5 s off，20 min）破碎細(xì)胞后，離心獲得菌體細(xì)胞粗提液。粗提液中的總蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)染料結(jié)合法測定［18］。在測得每份待測樣品的總蛋白濃度之后，用PBS緩沖液將每份待測樣品的總蛋白濃度調(diào)成一致。采用Varian Eclipse熒光分光光度計(jì)測定每份細(xì)菌粗提液的熒光強(qiáng)度，計(jì)算單位總蛋白的紅色熒光強(qiáng)度。用553 nm波長的光激發(fā)紅色熒光蛋白的熒光，測定其發(fā)射出的574 nm波長的光強(qiáng)［19-21］。

1.2.4 vbp2啟動子區(qū)被截短的熒光表達(dá)載體的構(gòu)建及被截短的啟動子活性的測定 為了確定個(gè)別調(diào)控位點(diǎn)在啟動子區(qū)的位置，我們對vbp2啟動子區(qū)進(jìn)行截短，得到不同長度的vbp2基因上游片段。將這些不同長度的vbp2基因上游片段用作啟動egfp基因表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的啟動子，連接到egfp基因起始密碼子的上游。然后將這些連上了不同長度的vbp2啟動子區(qū)DNA片段的egfp基因分別插入到?jīng)]有啟動子的質(zhì)粒中，以構(gòu)建用截成不同長度的vbp2啟動子啟動egfp基因表達(dá)的系列表達(dá)質(zhì)粒。無啟動子的質(zhì)粒構(gòu)建方法是：以P-F和P-R（均具有Hind III酶切位點(diǎn)）為引物，以pUCA19質(zhì)粒為模板進(jìn)行全質(zhì)粒PCR。之后通過Hind III酶切，T4連接酶連接，得到不含有l(wèi)acZ’啟動子的pUCA19載體，即pUCA19-N質(zhì)粒。

根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，在vbp2編碼區(qū)上游設(shè)計(jì)多條引物，分別為Q1-F、Q2-F、Q3-F、Q4-F、Q5-F、Q6-F、Q7-F、Q8-F（均具有 BamH I酶切位點(diǎn)），它們都可與引物Q1-R組成一對引物，通過PCR擴(kuò)增相應(yīng)的啟動子片段，片段大小分別為526 bp、463 bp、260 bp、165 bp、126 bp、97 bp、60 bp、20 bp。然后以eGFP-T質(zhì)粒為模板，Egfp-F、Egfp-R為引物，通過PCR擴(kuò)增綠色熒光蛋白egfp基因。利用重疊PCR技術(shù)，將上述不同長度的vbp2啟動子片段分別與egfp基因相連，構(gòu)建受不同長度vbp2啟動子控制的egfp基因系列表達(dá)片段。然后將這些表達(dá)片段通過BamH I和Hind III酶位點(diǎn)插入到無啟動子質(zhì)粒pUCA19-N中，即得到了一系列受不同長度vbp2啟動子控制的egfp基因表達(dá)質(zhì)粒。在這些egfp基因表達(dá)質(zhì)粒測序正確后，電轉(zhuǎn)至根癌農(nóng)桿菌GMI9017Δvbp2菌株。讓該菌株在誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)下由不同長度vbp2啟動子控制egfp基因的表達(dá)，收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，提取細(xì)胞粗提液，測定粗提液中單位總蛋白的綠色熒光強(qiáng)度。用488 nm波長的光激發(fā)綠色熒光蛋白的熒光，測定其發(fā)射出的508 nm波長的光強(qiáng)［22-23］。

2 結(jié)果

2.1 vbp2啟動子結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

用公共數(shù)據(jù)庫對vbp2基因啟動子區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測，結(jié)果提示，vbp2的啟動子區(qū)可能存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。預(yù)測的調(diào)控元件及其位點(diǎn)如圖1所示。主要有4種，分別是σ38因子結(jié)合位點(diǎn)、環(huán)腺苷酸受體蛋白結(jié)合位點(diǎn)（cap/crp）、fadR和rhaS。如果這些生物信息學(xué)的預(yù)測結(jié)果有一定可靠性的話，vbp2（atu4860）基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制將相當(dāng)復(fù)雜，不僅受多種因素調(diào)控，也可能受某種未知的調(diào)控機(jī)制所調(diào)節(jié)。鑒于vbp2基因可能存在復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，現(xiàn)階段我們僅對幾種最有可能存在的誘導(dǎo)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究。

圖1 生物信息學(xué)預(yù)測的vbp2基因啟動子區(qū)可能存在的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件Fig.1 Feasible transcriptional regulator in the promoter region of vbp2 gene predicted by bioinformatics

2.2 vbp2基因被rfp基因原位替代突變體菌株的構(gòu)建

為了能夠準(zhǔn)確地表征vbp2啟動子啟動轉(zhuǎn)錄的活性，我們將vbp2啟動子控制的vbp2基因替換成編碼紅色熒光蛋白的rfp基因，即可通過測定紅色熒光蛋白的表達(dá)量來表征該啟動子的活性。因此，構(gòu)建vbp2基因被rfp基因原位替代的突變體菌株就很重要。首先需要構(gòu)建用于根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行同源重組突變的質(zhì)粒。圖2所示是已經(jīng)構(gòu)建好的用于根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行同源重組突變的質(zhì)粒pEX18Km-rfp的酶切和PCR鑒定結(jié)果。測序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證該質(zhì)粒構(gòu)建正確。將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至根癌農(nóng)桿菌C58感受態(tài)細(xì)胞中，通過同源重組整合至根癌農(nóng)桿菌基因組中。經(jīng)第一次卡那霉素抗性正向篩選和第二次蔗糖敏感反向篩選，得到無卡那霉素抗性和蔗糖不敏感的原位替代菌株。對所獲得的突變體菌株，通過PCR和測序，以確定所獲突變體菌株準(zhǔn)確無誤，并將所獲的vbp2基因被rfp基因原位替代的突變體菌株取名為C58vbp2→rfp菌株。

圖2 用于進(jìn)行同源重組構(gòu)建根癌農(nóng)桿菌突變體的質(zhì)粒pEX18Km-rfp的鑒定Fig.2 Identification of plasmid pEX18Km-rfp used for the construction of A. tumefaciens mutant via homologous recombination

2.3 根癌農(nóng)桿菌粗提液中熒光蛋白濃度與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性驗(yàn)證

為了明確根癌農(nóng)桿菌粗提液中的其它成分是否會干擾熒光蛋白的測定，我們將野生型C58（不含熒光蛋白）和替代菌C58vbp2→rfp（含熒光蛋白）的粗提液中的蛋白濃度調(diào)成一致，并按不同比例混合，獲得含RFP蛋白粗提液占比分別為0%、20%、40%、60%、80%和100%的混合粗提液，并用熒光分光光度計(jì)測定這些混合粗提液的熒光強(qiáng)度。粗提液中RFP的比例與熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系見圖3，由圖可知，粗提液的熒光強(qiáng)度與粗提液中RFP蛋白的含量呈線性關(guān)系，說明粗提液中的其它物質(zhì)不會干擾RFP蛋白的熒光強(qiáng)度的測定。可以用粗提液的熒光強(qiáng)度來表示熒光蛋白的表達(dá)量。

圖3 根癌農(nóng)桿菌粗提液中RFP的含量與粗提液的熒光強(qiáng)度的關(guān)系Fig.3 Relationship between fluorescent intensity and RFP content in A. tumefaciens crude extract

2.4 乙酰丁香酮（AS）和鼠李糖（Rha）能夠誘導(dǎo) vbp2啟動子啟動熒光蛋白的表達(dá)

乙酰丁香酮（AS）是最常用來誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因的誘導(dǎo)物，同時(shí)VBP蛋白的一項(xiàng)重要功能就是將T-復(fù)合物招募到四型分泌系統(tǒng)處。因此，我們首先想到的就是AS是否能夠調(diào)控vbp2啟動子的活性。用不同濃度的AS誘導(dǎo)替代菌C58vbp2→rfp，提取這些經(jīng)不同AS濃度誘導(dǎo)的細(xì)胞粗提液，測定這些細(xì)胞粗提液的熒光強(qiáng)度。從圖4-A可以看出，熒光強(qiáng)度所代表的由vbp2啟動子啟動表達(dá)的RFP的量是受AS誘導(dǎo)調(diào)控的。當(dāng)AS濃度為150 μmol/L時(shí)，誘導(dǎo)vbp2啟動子啟動rfp基因表達(dá)的能力最強(qiáng)。

多種單糖也是誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因致瘤的誘導(dǎo)物。前面的生物信息學(xué)預(yù)測，vbp2啟動子可能存在一個(gè)RhaS蛋白結(jié)合位點(diǎn)，在大腸桿菌中RhaS與L-鼠李糖結(jié)合后可以激活相關(guān)基因的啟動子，啟動相關(guān)基因的表達(dá)。因此，我們測試了鼠李糖對vbp2啟動子控制的RFP表達(dá)的影響。圖4-B的結(jié)果顯示鼠李糖確實(shí)對vbp2基因啟動子控制的RFP的表達(dá)有調(diào)控作用。誘導(dǎo)vbp2基因啟動子控制的RFP表達(dá)的最適鼠李糖濃度為100 μmol/L。

圖4 不同濃度的乙酰丁香酮（A）和L-鼠李糖（B）誘導(dǎo)vbp2啟動子表達(dá)RFP的情況Fig. 4 vbp2 promotor-promoting RFP expressions induced by different concentrations of AS（A）or Rha（B）

2.5 vbp2啟動子中AS和Rha調(diào)控元件位置的確定

為了進(jìn)一步確定對AS和Rha誘導(dǎo)做出響應(yīng)的調(diào)控元件在vbp2啟動子區(qū)的具體位置。我們對vbp2的啟動子區(qū)域進(jìn)行了截短，被截短片段的長度和被截去的可能調(diào)控元件如圖5-A所示。讓這些不同長度的vbp2啟動子片段控制egfp基因的表達(dá)。再將這些帶有不同長度的vbp2啟動子片段的egfp基因分別插入到?jīng)]有啟動子的質(zhì)粒pUCA19-N中，獲得egfp基因分別受不同長度的vbp2啟動子片段控制的系列egfp表達(dá)質(zhì)粒。然后將這些egfp表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)至根癌農(nóng)桿菌GMI9017Δvbp2感受態(tài)細(xì)胞，將長出來的菌落進(jìn)行PCR鑒定，確定這些egfp表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)分別轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GMI9017Δvbp2菌株的細(xì)胞內(nèi)。鑒定結(jié)果見圖5-B，電泳條帶a-h對應(yīng)的片段大小分別 為 1 246 bp、1 183 bp、980 bp、885 bp、846 bp、817 bp、780 bp和740 bp，與預(yù)計(jì)相符，說明攜帶受不同長度的vbp2啟動子片段控制的egfp表達(dá)質(zhì)粒的系列根癌農(nóng)桿菌菌株構(gòu)建成功。

圖5 受不同長度的vbp2啟動子片段控制的egfp表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定。Fig.5 Construction and identification of the egfp expression plasmids controlled by different lengths of vbp2 promotor

在取得了這些攜帶受不同長度的vbp2啟動子片段控制的egfp表達(dá)質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌株后，我們分別用最適濃度的AS（150 μmol/L）和Rha（100 μmol/L）誘導(dǎo)這些菌株，測定這兩種物質(zhì)誘導(dǎo)不同長度的vbp2啟動子啟動egfp基因表達(dá)綠色熒光蛋白GFP的情況。從圖6-A可以看出，當(dāng)vbp2啟動子區(qū)縮短至起始密碼子上游260 bp處時(shí)，受其控制的egfp基因仍然能夠被AS誘導(dǎo)表達(dá)出綠色熒光蛋白，當(dāng)vbp2啟動子區(qū)縮短至起始密碼子上游165 bp處時(shí)，AS就不能誘導(dǎo)啟動子啟動egfp基因表達(dá)了。由此可以得出響應(yīng)AS誘導(dǎo)的調(diào)控元件位于vbp2上游的165 bp-260 bp區(qū)域。圖6-B是L-鼠李糖（Rha）誘導(dǎo)這些菌株表達(dá)GFP的情況，結(jié)果顯示，當(dāng)vbp2啟動子區(qū)縮短至起始密碼子上游165 bp處時(shí)，Rha仍然能夠誘導(dǎo)GFP的表達(dá)，當(dāng)vbp2啟動子區(qū)縮短至起始密碼子上游126 bp處時(shí)，Rha就誘導(dǎo)不了GFP的表達(dá)，說明，響應(yīng)Rha誘導(dǎo)的調(diào)控元件位于vbp2上游的126 bp-165 bp區(qū)域。

圖6 分別以150 μmol/L AS（A）和100 μmol/L Rha（B）誘導(dǎo)不同長度vbp2啟動子表達(dá)GFP的情況Fig. 6 GFP expression promoted by different lengths of vbp2 promotor under the induction of 150 μmol/L AS（A）or 100 μmol/L Rha（B）

3 討論

本研究通過構(gòu)建將vbp2基因的開放閱讀框（ORF）準(zhǔn)確地替換成rfp基因ORF的菌株來定量地研究vbp2啟動子的活性，使紅色熒光基因rfp在vbp2基因的原位上由vbp2基因的啟動子調(diào)控rfp基因的表達(dá)，這樣不僅可以準(zhǔn)確地定量vbp2啟動子的活性，而且可以真實(shí)地還原根癌農(nóng)桿菌在接收到誘導(dǎo)物信號之后是如何啟動vbp2基因表達(dá)的。通過細(xì)菌粗提液中熒光蛋白的含量與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性測定，證明了根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞粗提液中的其它物質(zhì)對熒光強(qiáng)度的測定沒有干擾。用AS和Rha兩種物質(zhì)分別對原位替代菌株誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)這兩種物質(zhì)都能誘導(dǎo)vbp2啟動子啟動rfp基因表達(dá)RFP蛋白。

利用截?cái)鄓bp2啟動子區(qū)的方法，進(jìn)一步確定了響應(yīng)AS誘導(dǎo)的調(diào)控元件位于vbp2上游的165 bp-260 bp區(qū)域。生物信息學(xué)分析預(yù)測，vbp2啟動子的165 bp-260 bp區(qū)域含有一個(gè)σ38因子結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們推測AS可能是通過影響σ38因子與該位點(diǎn)的結(jié)合來調(diào)控vbp2基因的啟動子。在其它革蘭氏陰性菌中的研究結(jié)果表明，σ38因子主要識別響應(yīng)環(huán)境脅迫的基因的啟動子，特別是識別一些與致病性（virulence）有關(guān)基因的啟動子［24-26］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與AS是誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌致病的最好誘導(dǎo)物的推測是非常吻合的［8，27］。AS誘導(dǎo)根癌農(nóng)桿菌的主要致病基因表達(dá)的機(jī)制已經(jīng)很清楚，那就是AS通過VirA/VirG雙組分系統(tǒng)誘導(dǎo)位于Ti質(zhì)粒上的vir基因表達(dá)［28-29］。VBP蛋白也影響根癌農(nóng)桿菌的致病，但vbp2基因位于根癌農(nóng)桿菌的線型染色體上，不在Ti質(zhì)粒上［13］。在這里我們證明AS也能誘導(dǎo)vbp2基因的表達(dá)，而且可能是通過影響σ38因子與啟動子的結(jié)合來調(diào)控vbp2基因的表達(dá)，這與已知的AS誘導(dǎo)調(diào)控根癌農(nóng)桿菌致病基因表達(dá)的機(jī)理是完全不同的，因此，值得我們進(jìn)一步研究和探討。

通過截?cái)鄓bp2啟動子區(qū)的方法，我們還確定了響應(yīng)Rha誘導(dǎo)的調(diào)控元件位于vbp2上游的126 bp-165 bp區(qū)域。生物信息預(yù)測結(jié)果顯示，該區(qū)域可能含有一個(gè)rhas位點(diǎn)。在大腸桿菌中，啟動子區(qū)rhaS位點(diǎn)的調(diào)控機(jī)制是RhaS蛋白需要與L-鼠李糖結(jié)合后才具有活性［30-31］。因此，下一步我們希望能夠表達(dá)根癌農(nóng)桿菌的RhaS蛋白，并驗(yàn)證根癌農(nóng)桿菌的RhaS蛋白是否能與L-鼠李糖形成復(fù)合物，并能夠特異性地結(jié)合vbp2啟動子區(qū)的這段DNA。此外，現(xiàn)有的研究還表明，RhaS蛋白調(diào)控的基因與細(xì)菌的碳源利用有關(guān)，調(diào)節(jié)處于不同生存條件（如病原菌的獨(dú)立生存或作為病原菌生存）下的碳源利用途徑［31-32］。我們以前的研究結(jié)果推測，VBP蛋白除了招募T-復(fù)合物到四型分泌系統(tǒng)處外可能還有其它生物學(xué)功能［14，16］。因此，根據(jù)這些研究結(jié)果和合理分析，我們初步推測，L-鼠李糖誘導(dǎo)vbp2基因表達(dá)的另一項(xiàng)功能可能是使根癌農(nóng)桿菌適應(yīng)宿主體內(nèi)的碳源利用途徑。當(dāng)然，還需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來支持這樣的推測。

4 結(jié)論

證明了vbp2基因分別受乙酰丁香酮和L-鼠李糖誘導(dǎo)，并確定了兩種誘導(dǎo)物的最適誘導(dǎo)濃度。同時(shí)，明確了vbp2啟動子區(qū)受乙酰丁香酮和L-鼠李糖誘導(dǎo)的調(diào)控元件分別位于vbp2起始密碼子上游165-260 bp和126-165 bp區(qū)域。