黃金鳳，王冬梅，呂天星，閆忠業(yè)，王穎達，楊 鋒，劉 志

（遼寧省果樹科學研究所，營口 115009）

目前，我國是世界上蘋果栽培面積最大、總產(chǎn)量最高的國家[1]。蘋果輪紋病是我國蘋果主產(chǎn)區(qū)危害最嚴重、發(fā)生最普遍的三大蘋果病害之一[2]。蘋果輪紋病主要分布于中國、日本、韓國等亞洲國家[3-5]。Xu 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，我國蘋果輪紋病由2 種主要病原引起，即葡萄座腔菌（B.dothidea）和粗皮葡萄座腔菌（B.kuwatsukai）。輪紋病菌是脅迫相關(guān)病原體，在洪澇、干旱等不適宜條件下，可導(dǎo)致宿主出現(xiàn)感染癥狀[7-8]。該病菌不僅能夠侵染枝干，導(dǎo)致枝干粗皮或潰瘍，從而出現(xiàn)樹體衰弱現(xiàn)象，還能侵染果實，形成同心輪紋病斑，導(dǎo)致果實腐爛[9]，嚴重影響蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)。在我國，蘋果輪紋病最早于1928 年被發(fā)現(xiàn)，隨著易感蘋果輪紋病蘋果品種‘富士’的大面積推廣，蘋果輪紋病發(fā)病率增加，我國蘋果產(chǎn)業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟損失[10]。植物病害的發(fā)生與其生態(tài)環(huán)境是密切相關(guān)的，不同的生態(tài)環(huán)境常造成病原的變化或變異[11]，從而出現(xiàn)不同地理種群的菌株毒力不同的現(xiàn)象[12-13]。為明確蘋果輪紋病病原菌的種類，本研究開展遼寧省熊岳地區(qū)病原菌的分離鑒定，及蘋果品種（系）對蘋果輪紋病抗性評價工作，為其防治及抗病品種改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016 年和2018 年在遼寧省營口市鲅魚圈區(qū)熊岳鎮(zhèn)進行。供試菌株分離自遼寧省果樹科學研究所蘋果育種課題組實驗基地蘋果樹。病原菌采自遼寧省果樹科學研究所10 年生蘋果樹主干。用手術(shù)刀片切取病健交界處的組織，采用常規(guī)組織分離法分離病原菌[14]。

蘋果輪紋病抗性評價的材料包括蘋果品種8個，‘岳冠’‘岳陽紅’‘岳華’‘岳艷’‘岳蘋’‘望山紅’‘寒富’‘雞冠’；決選優(yōu)系8 個，15-26、23-42、23-63、26-34、29-24、58-34、62-45、74-178。

1.2 病原菌鑒定

（1）形態(tài)學鑒定。病原菌在PDA 平板上培養(yǎng)5～7 d，逐日觀察記錄培養(yǎng)特征，挑取分生孢子進行顯微形態(tài)觀測，記錄形狀及大小。

（2）致病性測定。選取1 年生蘋果新梢，用75%的酒精擦拭，風干。用10 cm 長的濾紙條蘸取孢子懸液，濃度105個/mL，包裹于新梢上保濕7 d，以接種無菌水的1 年生枝條為對照，觀察發(fā)病情況。

（3）病原菌的分子鑒定。用解剖刀刮取PDA培養(yǎng)基表面菌絲，液氮中充分研磨成粉末，CTAB 法提取基因組DNA。采取通用引物ITS1 和ITS4，對病菌的ITS 區(qū)進行PCR 擴增[15]。25 μL PCR 反應(yīng)體系：2× Es Taq Master Mix 12.5 μL、DNA 模板1 μL（50 mg/L）、上下游引物各 1 μL（10 pmol/L）、ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，退火 60 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min。用DNA 凝膠回收試劑盒，回收目的片段；pMD18-T 載體克隆該片段；送公司測序；并開展序列分析[14]。

1.3 蘋果品種（系）抗蘋果輪紋病鑒定

（1）田間自然發(fā)病調(diào)查。2016 年和2018 年蘋果樹休眠期，記錄材料樹干的自然發(fā)病情況[13]。分級標準為：0 級，免疫，基本無病；1 級，高抗，輕微感病，主干上病斑呈分散狀；2 級，中抗，感病較輕，主干上少部分病斑連片，主枝病斑呈分散狀；3 級，中感，感病較重，主干上有較多病斑，主枝上少部分病斑連片；4 級，高感，嚴重感病，主干、主枝上病斑多已連片，側(cè)枝病斑較多，呈分散狀。

（2）人工接種抗性鑒定。方法同田間自然發(fā)病調(diào)查，10 月末調(diào)查新梢發(fā)病情況。病情分級與種質(zhì)資源抗病評價標準參考楊華等[16]，略有改動。

病情指數(shù)＝［∑（發(fā)病枝數(shù)×相應(yīng)級值）/（調(diào)查總枝數(shù)×4）］×100

根據(jù)病情指數(shù)，利用SPSS 軟件采用K-means cluster 方法進行聚類分析，并結(jié)合不同病級枝條的分布情況，確定抗性評價標準：高抗，病情指數(shù)＜30；中抗，病情指數(shù)30～49；中感，病情指數(shù)50～64；高感，病情指數(shù)≥65。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果輪紋病病原菌的形態(tài)特征

生長在PDA 培養(yǎng)基上的菌落圓形，無褶皺，氣生菌絲生長較密集，初期白色，生長后期變?yōu)榛野咨梁谏?，背面可見黑色色素沉著。刮除氣生菌絲，置于黑光燈下培養(yǎng)，菌落表面可產(chǎn)生顆粒狀子實體，墨綠色至黑色，較堅硬，突起于培養(yǎng)基表面，分生孢子無色，單胞，紡錘形，長18.6～25.0 μm，寬3.3～6.0 μm（圖1）。

鑒定結(jié)果表明，該病原菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀基本符合魏景超[17]提出的關(guān)于蘋果輪紋病病原菌的分類標準，認為該病原菌為葡萄座腔菌（B.dothidea）。

圖1 蘋果輪紋病病原菌菌落及其分生孢子的形態(tài)特征

2.2 分離菌株的致病性

病菌孢子噴霧接種于蘋果新梢，1 個月左右發(fā)病，癥狀與田間癥狀相同（圖2），即發(fā)病初期，以皮孔為中心形成褐色凸起圓形小病瘤，病瘤致密，直徑0.7～1 mm，并逐步擴大，隨著時間推移，枝條增粗，嚴重的病瘤連成片。對回接發(fā)病的組織進行分離后，能夠重新獲得該原病菌，符合柯赫氏法則，表明分離的菌株即為蘋果輪紋病的致病菌。

2.3 菌株的ITS 序列分析

通過PCR 擴增，得到736 bp 的特異性片段。經(jīng)BLAST 比對，與Botryosphaeria dothidea相似性最高，為94%。形態(tài)學觀察、致病性測定及分子生物學鑒定均表明，分離出的病原菌為引起輪紋病的葡萄座腔菌（B.dothidea）。

2.4 蘋果品種（系）抗輪紋病鑒定

圖2 感染蘋果輪紋病的蘋果枝干

從表1 可以看出，試材病情指數(shù)為21.3～92.5。其中高抗材料2 份，分別是‘雞冠’、74-178；中抗材料4 份，分別是‘岳冠’‘岳陽紅’‘寒富’和62-45；中感材料4 份，分別是‘岳華’‘岳蘋’、23-42、29-24；高感材料6 份，分別是‘望山紅’‘岳艷’、15-26、23-63、26-34、58-34。

2016 年田間調(diào)查整體發(fā)病較輕，其中，高抗材料5 份，占31.3%；中抗材料7 份，占43.8%；中感材料2 份，占12.5%；高感材料2 份，占12.5%（表1）。2018 年高感材料的鑒定結(jié)果與2016 年一致（‘望山紅’、15-26），但抗病材料數(shù)量略有下降，感病材料數(shù)量略有增加。

比較人工接種和田間發(fā)病結(jié)果，完全一致的材料有8 份，包括‘雞冠’和74-178 2 份高抗材料，‘岳陽紅’和62-45 2 份中抗材料。就人工接種和田間調(diào)查的一致率來看，隨著調(diào)查時間的延長，一致率逐漸提高，2016 年為50.0%，2018 年為75.0%。

表1 蘋果品種（系）對B.dothidea 菌株的抗性

3 討論與結(jié)論

3.1 蘋果輪紋病病原菌的鑒定

蘋果輪紋病是影響蘋果生產(chǎn)的重要病害，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。蘋果輪紋病菌在世界范圍內(nèi)分布廣泛，種類與寄主眾多，其準確鑒定對于病害的流行及防控具有重要意義[18]。據(jù)報道，我國蘋果輪紋病由2 種主要病原引起，即葡萄座腔菌B.dothidea和粗皮葡萄座腔菌B.kuwatsukai[6]。葡萄座腔菌引起病瘤小，可表現(xiàn)為潰瘍癥狀；粗皮葡萄座腔菌引起病瘤大，最后發(fā)展成為粗皮癥狀[19]。本研究通過病原菌分離、形態(tài)特征觀測、rDNA-ITS序列測定，對遼寧熊岳蘋果枝干輪紋病病原菌進行了鑒定，明確了該病病原為葡萄座腔菌。研究結(jié)果與Liu[20]和Wang[21]等一致，為蘋果輪紋病的防治提供一定參考。

3.2 蘋果品種（系）對蘋果輪紋病的抗性鑒定

田間調(diào)查表明，同一材料不同年份間的抗性存在差異。如2016 年的‘岳冠’和‘寒富’表現(xiàn)高抗，而2018 年調(diào)查結(jié)果表現(xiàn)為中抗。這可能是由于田間自然發(fā)病情況難以控制，溫度、濕度、降水等都會影響到蘋果輪紋病的發(fā)生與為害。并且，隨著蘋果樹在田間栽植年份的延長，病害發(fā)生逐漸加重[13]。通過人工接種與田間自然發(fā)病調(diào)查的綜合評價，篩選出‘雞冠’、74-178 等2 份穩(wěn)定高抗輪紋病材料，可作為抗病育種的親本進一步雜交利用。