殷 輝，周建波，呂 紅，秦 楠，趙曉軍

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

蘋果樹腐爛病是由黑腐皮殼屬（Valsaspp.）病菌引起的一種枝干病害，在我國各個種植區(qū)均有發(fā)生[1]，其中V.mali為主要的致病種[2]。生產(chǎn)中主要依靠化學(xué)藥劑防治蘋果樹腐爛病[3]，然而存在病疤復(fù)發(fā)率高[4]、病原菌抗藥性[5]及果園環(huán)境污染等問題[6-7]。因此探索環(huán)境友好且具有良好效果的防治方法顯得尤為重要。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類重要的生防資源，具有抑制多種植物病原菌的能力（如：Rhizoctonia solani、Fusarium oxysporum、Pseudomonassolanacearum、Valsaspp.等），對人畜無害、環(huán)境友好，備受國內(nèi)外研究者的關(guān)注[8]。迄今，已發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌對蘋果樹腐爛病菌有較好抑制作用的菌株有BS-0728[9]、LZ-1201[10]、E1R-j[11]、LF17 等[4]。在眾多優(yōu)良菌株中，BS-0728 是屈指可數(shù)的成功開發(fā)并應(yīng)用于防治蘋果樹腐爛病[12]的菌株。然而在生產(chǎn)實(shí)踐中時常由于枯草芽孢桿菌的防效不穩(wěn)定、發(fā)揮作用慢、易受環(huán)境影響等缺點(diǎn)而受到制約[4,8,12]。

有研究表明，枯草芽孢桿菌可與甲基硫菌靈[13]、嘧菌酯[14]、噻呋酰胺[15]、咪酰胺[16]等化學(xué)藥劑聯(lián)用，進(jìn)而協(xié)同防治病害，既可提高枯草芽孢桿菌的穩(wěn)定性和防效，又可減少化學(xué)藥劑的使用量。由此，探索枯草芽孢桿菌與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合防治蘋果樹腐爛病具有重要的指導(dǎo)意義。本研究擬篩選具有協(xié)同作用的枯草芽孢桿菌與化學(xué)藥劑組合，探討枯草芽孢桿菌與化學(xué)藥劑協(xié)同防治蘋果樹腐爛病的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisLF17，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果蔬菜病害課題組分離獲得。使用NA 培養(yǎng)基，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)菌株LF17[4]。

蘋果樹腐爛病菌Valsa maliJZ069，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院果蔬菜病害課題組分離獲得[17]。使用PDA 培養(yǎng)基，在22 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

95%甲基硫菌靈原藥，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)；97%苯醚甲環(huán)唑原藥，杭州大陽化工有限公司生產(chǎn)；97.5%嘧菌酯原藥，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 枯草芽孢桿菌LF17和化學(xué)藥劑對菌絲生長的抑制效果

將枯草芽孢桿菌LF17 接種于NB 培養(yǎng)基，置于28 ℃搖床150 r/min 培養(yǎng)3 d 后獲得發(fā)酵液。用無菌水將發(fā)酵液稀釋成菌含量為1.0×109cfu/mL 的母液[4]。采用菌絲生長速率法測定[18]，用無菌水稀釋成不同系列濃度的菌懸液，吸取系列濃度菌懸液加入約45 ℃的PDA，充分混合均勻，制成含系列濃度枯草芽孢桿菌的PDA 平板（表1）。

表1 枯草芽孢桿菌LF17和化學(xué)藥劑的最終系列濃度

將95%甲基硫菌靈原藥溶于丙酮，配成1.0×104μg/mL 的母液。將97%苯醚甲環(huán)唑、97.5%嘧菌酯2 種原藥分別溶于甲醇，配成1.0×104μg/mL 的母液。試驗(yàn)時用無菌水分別將3 種殺菌劑母液稀釋成系列濃度藥液，加至50 ℃左右的PDA 中，制備含系列濃度藥液的PDA 平板（表1）。

采用菌絲生長速率法[17]測定菌絲對化學(xué)藥劑的敏感性。將腐爛病菌的菌餅（直徑0.5 cm）接種至含藥PDA 中心，以不含藥PDA 為對照，每個處理重復(fù)3 次。25 ℃培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率。

抑制率（%）=｛［（對照菌落直徑-0.5）-（藥劑處理菌落直徑-0.5）］/（對照菌落直徑-0.5）｝×100

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。以化學(xué)藥劑濃度的對數(shù)值為自變量（X），相對應(yīng)的菌絲生長抑制率的機(jī)率值為因變量（Y），用回歸法擬合出毒力回歸曲線得到回歸方程，進(jìn)而求出有效抑制中濃度EC50值。

1.3 化學(xué)藥劑對枯草芽孢桿菌LF17生物活性影響的測定

將3 種化學(xué)藥劑分別配成濃度為50、100、150、200 mg/L 的含藥NA 平板，將10 μL 枯草芽孢桿菌LF17 的菌懸液（1.0×109cfu/mL）滴在含藥平板中央，用玻璃棒均勻涂布于NA 表面，每處理重復(fù)3次，以同等體積的無菌水為對照，28 ℃培養(yǎng)2 d 后檢查菌體生長情況，統(tǒng)計菌落數(shù)量。

1.4 枯草芽孢桿菌LF17與甲基硫菌靈復(fù)配劑的毒力測定

依據(jù)1.3 試驗(yàn)結(jié)果，分別配制枯草芽孢桿菌LF17 和甲基硫菌靈2 種單劑的母液，濃度為1.36×107cfu/mL 和1.027 1 μg/mL。再將LF17 的菌懸液與甲基硫菌靈按體積比為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10分別配制復(fù)配劑，重復(fù)3 次。測量各個處理的菌落直徑，計算平均抑制率、預(yù)期抑制率及毒性比率[19]。根據(jù)毒性比率值，判斷不同配方的協(xié)同作用效果。毒性比率＞1，表示為增效作用；毒性比率＜1，表示為拮抗作用；毒性比率＝1，表示為相加作用[19]。

毒性比率＝實(shí)際抑制率/預(yù)期抑制率

預(yù)期抑制率（%）＝（枯草芽孢桿菌LF17 菌懸液EC50劑量實(shí)際抑制率×配比中的百分率）+（甲基硫菌靈EC50劑量實(shí)際抑制率×配比中的百分率）

1.5 復(fù)配劑協(xié)同防治蘋果樹腐爛病的效果測定

采用燙傷接種測定離體枝條的防治效果[20]。選取2 年生背上枝，截成120 cm 的枝段，端口封蠟，自來水沖洗2 次后，用75%乙醇表面消毒，無菌水沖洗3 次。用鐵釘帽（直徑為0.50 cm）燙傷枝段樹皮，每個枝段1 個燙傷口，在燙傷口處接種腐爛病菌菌餅（直徑為0.50 cm），以無菌PDA 為對照、每個處理接種3 個枝條。在接種部位上方1～2 cm 處加1 塊無菌水浸濕的脫脂棉，用塑料薄膜將其和接種體包扎好。接種的枝條扦插于含水量40%的無菌細(xì)沙中，在溫度25 ℃、相對濕度40%條件下培養(yǎng)。

待傷口擴(kuò)展后，挑選病斑擴(kuò)展長度為（1.00±0.30） cm 的枝條進(jìn)行離體枝條腐爛病菌抑菌試驗(yàn)。用小刀在病斑處刻線，深至木質(zhì)部?？v橫交錯，距離約0.50 cm。將傷口刻好線后，用毛筆在燙傷部位分別涂抹LF17 菌懸液與甲基硫菌靈復(fù)配劑（濃度為1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL，按體積比5∶5配制）、枯草芽孢桿菌LF17 單劑（濃度為1.36×107cfu/mL）、甲基硫菌靈單劑（濃度為1.027 1 μg/mL），以無菌水作為對照。接種后的枝條插入含水量約40%的無菌細(xì)沙中，于25 ℃保濕培養(yǎng)10 d，觀察記錄枝條的發(fā)病情況，測量病斑長度，計算防治效果、試驗(yàn)重復(fù)3 次[7]。

防治效果（%）=［（對照組病斑長度-處理組病斑長度）/對照組病斑長度］×100

田間防效試驗(yàn)：2018—2019 年的3 月進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，刮治時徹底刮除病組織，深至木質(zhì)部，四周外延0.50 cm，盡量使刮治傷口縱長、橫窄，切面光滑。刮除病組織后，分別涂抹上述配制好的枯草芽孢桿菌LF17 與甲基硫菌靈復(fù)配劑（濃度為1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL，按體積比5∶5 配制）、枯草芽孢桿菌LF17 單劑（濃度為1.36×107cfu/mL）、甲基硫菌靈單劑（濃度為1.027 1 μg/mL）使其完全覆蓋刮治后的傷口并外延1.50 cm，處理后每隔10 d再涂2 次。以無菌水作為對照，每個處理20 個病疤，3 個月后測量傷口愈合面積，次年調(diào)查病疤復(fù)發(fā)情況。愈合面積采用坐標(biāo)圖紙法測定，用1 張紙在傷口總面積部位外圍和內(nèi)部未愈合部位外圍畫外圍線，然后把2 個周線描繪在單個方格為1 cm2的坐標(biāo)圖紙上，計算愈合面積、病疤復(fù)發(fā)率。

病疤復(fù)發(fā)率（%）=（復(fù)發(fā)病疤數(shù)/調(diào)查總病疤數(shù)）×100

數(shù)據(jù)采用Excel 2003 進(jìn)行圖表處理，并采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌LF17 和3 種化學(xué)藥劑對菌絲生長的影響

3 種化學(xué)藥劑甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、嘧菌酯對蘋果樹腐爛病菌菌絲的生長均有抑制作用。其中，苯醚甲環(huán)唑抑菌效果最好，EC50為0.309 4 μg/mL；嘧菌酯的抑菌效果最差，EC50為7.643 6 μg/mL；甲基硫菌靈的抑菌效果居中，EC50為1.027 1 μg/mL?？莶菅挎邨U菌LF17 含菌量為1.0×105～1.0×109cfu/mL 時，對蘋果樹腐爛病菌均有一定的抑制作用，抑制率范圍為21.3%～79.4%，其抑制中濃度為1.36×107cfu/mL（表2）。

表2 枯草芽孢桿菌LF17和3種化學(xué)藥劑對蘋果樹腐爛病菌的毒力測定

2.2 3種化學(xué)藥劑對枯草芽孢桿菌LF17生物活性的影響

在含5～100 μg/mL 甲基硫菌靈的NA 培養(yǎng)基上菌株LF17 能正常生長。3 種化學(xué)藥劑中甲基硫菌靈與菌株LF17 的相容性最好，相比對照組的菌落數(shù)差異不顯著；其次為苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯。當(dāng)苯醚甲環(huán)唑和嘧菌酯濃度為50 μg/mL 時，相比對照組的菌落數(shù)顯著減少；濃度為100 μg/mL 時，菌株LF17的生長受到顯著影響（表3）。

表3 加入3 種不同濃度化學(xué)藥劑枯草芽孢桿菌LF17 菌落的生長情況

2.3 枯草芽孢桿菌LF17與甲基硫菌靈復(fù)配對蘋果樹腐爛病病菌的聯(lián)合毒力

枯草芽孢桿菌LF17 與甲基硫菌靈的相容性最好，將LF17 菌懸液與甲基硫菌靈（濃度為1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL）按不同體積復(fù)配測定聯(lián)合毒力。當(dāng)菌株LF17 與甲基硫菌靈體積比分別為7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7 時，復(fù)配劑具有增效作用，實(shí)際抑菌率分別為65.78%、79.25%、81.36%、60.22%、62.81%。其中，體積比為5∶5時增效作用最強(qiáng)，抑菌率最高，為81.36%，毒性比率為1.660 2（表4）。

表4 枯草芽孢桿菌LF17與甲基硫菌靈復(fù)配對蘋果樹腐爛病病菌的聯(lián)合毒力

2.4 復(fù)配劑對蘋果樹離體枝條的保護(hù)作用

枯草芽孢桿菌LF17 菌懸液與甲基硫菌靈按體積比5∶5 配制的復(fù)配劑（濃度為1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL），對蘋果樹離體枝條的防治效果最高，為74.05%，顯著高于單劑型枯草芽孢桿菌LF17和甲基硫菌靈的防效，二者分別為54.59%和46.98%（圖1）；涂抹藥劑的病斑要顯著小于對照（圖2），涂抹復(fù)配劑的病疤長度為1.16 cm，顯著小于單劑型枯草芽孢桿菌LF17 和甲基硫菌靈，二者分別為2.03、2.37 cm（圖1）。

圖1 枯草芽孢桿菌LF17與甲基硫菌靈5∶5復(fù)配劑在離體枝條上對蘋果樹腐爛病的防治效果

圖2 枯草芽孢桿菌LF17與甲基硫菌靈5∶5復(fù)配劑對離體枝條上病斑形成的影響

2.5 復(fù)配劑對蘋果樹腐爛病的田間防治效果

蘋果樹腐爛病病樹施用枯草芽孢桿菌LF17 菌懸液與甲基硫菌靈按體積比5∶5 配制的復(fù)配劑（濃度為1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL），蘋果樹腐爛病的復(fù)發(fā)率為5.84%，顯著低于單劑枯草芽孢桿菌LF17（1.36×107cfu/mL）和甲基硫菌靈（1.027 1 μg/mL）處理，二者的復(fù)發(fā)率分別為6.59%、13.65%；使用枯草芽孢桿菌LF17（1.36×107cfu/mL）與甲基硫菌靈（1.027 1 μg/mL）復(fù)配劑接種后，病疤愈合面積為9.56 cm2，顯著高于單劑枯草芽孢桿菌LF17和甲基硫菌靈，二者病疤愈合面積分別為7.54、4.85 cm2（圖3）。

圖3 枯草芽孢桿菌LF17與甲基硫菌靈5∶5復(fù)配劑及單劑對蘋果樹腐爛病的田間防治效果

3 結(jié)論與討論

本研究探索枯草芽孢桿菌與甲基硫菌靈復(fù)配協(xié)同防治蘋果樹腐爛病的作用。室內(nèi)毒力測定及田間試驗(yàn)表明，枯草芽孢桿菌LF17 菌懸液與甲基硫菌靈按體積比5∶5 配制的復(fù)配劑（濃度為1.36×107cfu/mL+1.027 1 μg/mL），對蘋果樹腐爛病菌的抑制有明顯的增效作用，抑菌率為81.36%，防治效果為74.05%，復(fù)發(fā)率為5.84%，顯著優(yōu)于2 個單劑的防治效果。相比涂抹3%甲基硫菌靈糊劑（劑量125 g/m2），本研究復(fù)配劑中甲基硫菌靈的使用量減少約60%[21-22]。已有報道證實(shí)枯草芽孢桿菌與咪酰胺混配對蘋果樹腐爛病菌（V.mali）等的抑菌率達(dá)到100%[16]，枯草芽孢桿菌與甲基硫菌靈混配對茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）的抑菌率比單劑提高31%～44%[13]，枯草芽孢桿菌與化學(xué)藥劑聯(lián)用表現(xiàn)為協(xié)同增效作用[13,16]。因此，探索枯草芽孢桿菌與甲基硫菌靈協(xié)同防治蘋果樹腐爛病具有重要的指導(dǎo)意義，在穩(wěn)定防治效果的同時還能減少化學(xué)藥劑的使用量。

生產(chǎn)中主要采用刮治并涂抹化學(xué)藥劑防治蘋果樹腐爛病，后期傷口愈合能力差，長期裸露易滋生病菌，病疤復(fù)發(fā)率高[4]。本試驗(yàn)使用刮治并涂抹甲基硫菌靈與菌株LF17 菌懸液復(fù)配劑防治蘋果樹腐爛病，病疤復(fù)發(fā)率為5.84%，傷口愈合面積為9.56 cm2，顯著高于單獨(dú)使用枯草芽孢桿菌或甲基硫菌靈。枯草芽孢桿菌菌懸液中含有能促進(jìn)生長的物質(zhì)，可以促進(jìn)傷口愈合，進(jìn)而降低腐爛病的復(fù)發(fā)[23]。

已有研究結(jié)果表明，甲基硫菌靈[13]、嘧菌酯[14]、噻呋酰胺[15]、咪酰胺[16]等與枯草芽孢桿菌聯(lián)用可以起到協(xié)同作用，彌補(bǔ)生防菌發(fā)揮作用慢、田間防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，從而更好地發(fā)揮生物防治作用。但是，對于枯草芽孢桿菌與甲基硫菌靈協(xié)同增效的作用機(jī)制還有待于深入研究，從而為更好地利用枯草芽孢桿菌提供技術(shù)支撐。