趙穩(wěn) 李智 杜記濤 趙衛(wèi)杰 陳廣龍 曹建 萬(wàn)相斌

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，其中直腸癌約占所有CRC的30%［1］。與西方國(guó)家相比，中國(guó)直腸癌比例更高，占半數(shù)以上［2］。以5-氟尿嘧啶（5-FU）或卡培他濱為基礎(chǔ)的術(shù)前放化療聯(lián)合全直腸系膜切除術(shù)（total mesorectal ex?cision，TME）是局部進(jìn)展期直腸癌（locally advanced rectal cancer，LARC）患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法［3］。與單純手術(shù)相比，新輔助放化療（neoadjuvant chemoradiother?apy，NCRT）可顯著降低局部復(fù)發(fā)率，增加根治性手術(shù)的可能性［4］。有研究顯示，患者對(duì)NCRT 的治療反應(yīng)不一致，從病理完全緩解（pathologic complete re?sponse，pCR）到完全耐藥不等［5-6］。目前，臨床工作中仍缺乏足夠的證據(jù)來(lái)預(yù)測(cè)直腸癌對(duì)新輔助治療的耐藥性。本研究旨在探討臨床生物學(xué)指標(biāo)與NCRT 療效的關(guān)系以及pCR 對(duì)預(yù)后的影響，以期為該類(lèi)患者個(gè)體化治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2014年1月至2017年12月于鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的115 例LARC 患者的臨床病理資料，其中失訪10例，7例臨床病理資料不完整，最終98例納入本研究。根據(jù)第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行TNM 分期，所有患者新輔助治療前均行胸部CT、全腹部CT以及直腸MRI。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）術(shù)前腸鏡檢查經(jīng)病理確診為直腸腺癌；2）經(jīng)直腸MRI 或胸腹部CT 或超聲內(nèi)鏡等檢查證實(shí)，治療前臨床分期為進(jìn)展期直腸癌（T3、T4 期或N1～2）；3）腫瘤下緣距肛緣10 cm以下；4）無(wú)放化療和手術(shù)禁忌證；5）臨床病理及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）復(fù)發(fā)性直腸癌；2）術(shù)前有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；3）合并其他腫瘤既往史。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 新輔助化療方案：1）XELOX：卡培他濱1 000 mg/m2，口服，2 次/d，d1～14；奧沙利鉑130 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注2 h，d1、22。每21 天為1 個(gè)周期。2）FOLFOX：奧沙利鉑85 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注2 h，d1；亞葉酸鈣400 mg/m2，持續(xù)靜脈滴注2 h，d1；5-FU 400 mg/m2，靜脈推注，d1，隨后以2 400 mg/m2持續(xù)靜脈滴48 h，d1、2。14 d為1個(gè)周期?；熎陂g同步放療。

放療方案：利用調(diào)強(qiáng)放射治療技術(shù)（intensitymodulated radiation therapy，IMRT）對(duì)直腸瘤床、亞臨床病灶及盆腔區(qū)域淋巴引流區(qū)給予放療，總劑量40～50 Gy，2.0 Gy/次，分20～25 次完成。所有患者均按計(jì)劃完成新輔助治療，NCRT后6～8周內(nèi)按TME標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)。

根據(jù)術(shù)后病理情況以及患者意愿決定是否行輔助化療，其中化療以氟尿嘧啶類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的方案，包括FOLFOX、XELOX或卡培他濱單藥。

1.2.2 腫瘤消退評(píng)價(jià) 采用改良Ryan“0～3級(jí)”評(píng)分法［8］對(duì)腫瘤消退程度（TRG）評(píng)分：0 分：腫瘤完全消退，標(biāo)本中無(wú)可見(jiàn)的癌細(xì)胞；1 分：明顯消退，僅可見(jiàn)單個(gè)癌細(xì)胞，伴有明顯組織纖維變性；2 分：部分反應(yīng)，尚有殘留腫瘤；3 分：腫瘤組織反應(yīng)差或者無(wú)反應(yīng)，幾乎無(wú)腫瘤退縮。TRG 0～1 分：腫瘤反應(yīng)良好，TRG 2～3 分：腫瘤反應(yīng)不佳。pCR 的定義是直腸癌NCRT 后手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本和淋巴結(jié)在顯微鏡下腫瘤細(xì)胞完全消失（ypT0N0）。

1.2.3 DNA檢測(cè)方法 術(shù)前活檢組織或術(shù)后離體標(biāo)本用4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片及H&E染色，選取富于腫瘤細(xì)胞的區(qū)域，保證腫瘤成分在80%以上。使用DNA 提取試劑盒（德國(guó)QIAGEN 公司），通過(guò)DNA純化，提取石蠟切片中腫瘤組織基因組DNA，聚合酶鏈反應(yīng)和焦磷酸測(cè)序檢測(cè)KRAS基因第12、13和61 密碼子，NRAS 基因第12、13、59 和61 密碼子及BRAF 基因第468、596 和600 密碼子突變，然后利用ABI PRISM 3730DNA 分析儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）直接測(cè)序，測(cè)定KRAS、NRAS及BRAF突變狀態(tài)。

1.2.4 隨訪 定期復(fù)查和電話隨訪。復(fù)查內(nèi)容包括體格檢查、生化指標(biāo)、胸片及腹部彩超，當(dāng)懷疑有活動(dòng)性腫瘤，行CT 或MRI 檢查。以手術(shù)日起為隨訪開(kāi)始時(shí)間，每3 個(gè)月進(jìn)行1 次隨訪，隨訪截止日期為2020年4月，中位隨訪時(shí)間為36（3～75）個(gè)月。無(wú)病生存時(shí)間（disease-free survival，DFS）按從手術(shù)日開(kāi)始至疾病首次復(fù)發(fā)的時(shí)間進(jìn)行計(jì)算?？偵鏁r(shí)間（overall survival，OS）定義為手術(shù)至患者死亡或隨訪截止的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad 8.0.2 軟件繪制生存曲線。分類(lèi)變量比較采用χ2檢驗(yàn)，采用二元Logistic 回歸分析影響pCR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Spearman 等級(jí)相關(guān)分析變量共線性。單因素生存分析采用Kaplan-Meier 法，組間比較應(yīng)用Logrank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床病理、基因突變及腫瘤消退特點(diǎn)

98例患者中男性62例、女性36例，中位年齡55（23～81）歲；腺癌77例，黏液腺癌21例；高中分化60例，低分化38例；腫瘤距肛緣中位距離5.0（3.0～10.0）cm。術(shù)前分期（cTNM）：Ⅱa期30例，Ⅱb期19例，Ⅱc期12例，Ⅲb期26例，Ⅲc期11例。KRAS和BRAF基因突變率分別是33.7%（33/98）、6.1%（6/98）。NCRT后，19例患者獲得pCR，pCR率為19.4%。其中TRG 0分19例，TRG 1分31例，TRG 2 分38例，TRG 3分10例，腫瘤消退良好者（TRG 0～1分）和反應(yīng)不佳者（TRG 2～3分）分別占51.0%和49.0%。

2.2 臨床病理學(xué)指標(biāo)與pCR之間的關(guān)系

單因素分析顯示，術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、治療前CEA水平、腫瘤大小、腫瘤侵犯腸壁周徑程度、KRAS基因狀態(tài)與直腸腺癌NCRT后pCR率高低有關(guān)（均P<0.05，表1）。選擇NCRT后pCR作為因變量，將單因素分析有意義的cN分期、治療前CEA（μg/L）、腫瘤大小（cm）、腫瘤侵犯腸壁周徑和KRAS基因狀態(tài)指標(biāo)為自變量，多因素二元Logistic回歸分析顯示，治療前CEA≤5 μg/L以及腫瘤侵犯腸壁周徑（≤1/2）是影響直腸腺癌NCRT后pCR的獨(dú)立因素（均P<0.05，表2）。

表1 臨床病理特征與術(shù)前放化療后pCR的相關(guān)性 例（%）

表1 臨床病理特征與術(shù)前放化療后pCR的相關(guān)性 例（%）（續(xù)表1）

表2 LARC患者術(shù)前放化療后病理完全緩解的Logistic回歸多因素分析

2.3 生存分析

截至隨訪結(jié)束共復(fù)發(fā)24例，其中局部復(fù)發(fā)8例、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移16 例，包括肝轉(zhuǎn)移12 例、肺轉(zhuǎn)移3 例、骨與腹膜同時(shí)轉(zhuǎn)移1 例；死亡9 例。98 例LARC 患者3年DFS 為76.2%，3年OS 為90.7%。pCR 組的3年DFS（100%）顯著高于非pCR組（71.1%），兩組患者無(wú)病生存比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖1A）。pCR組的3年OS（100%）高于非pCR組（88.5%），兩組患者累積生存比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1B）。

98 例患者中，腫瘤反應(yīng)良好（TRG 0～1 分）組和腫瘤反應(yīng)不佳（TRG 2～3 分）組3年DFS 分別為89.5%和64.8%，兩組患者無(wú)病生存比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖2A）；兩組3年OS 分別為95.8%和85.5%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2B）。

A：DFS；B：OS

圖2 TRG 0～1分組和TRG 2～3分組LARC患者生存比較

3 討論

術(shù)前放化療是LARC患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，目的是降低分期，縮小腫瘤體積，提高保肛率，改善患者生存質(zhì)量［9］。行NCRT 后達(dá)到pCR 的患者比例不高，大部分患者僅獲得部分退縮。對(duì)于獲得pCR 的患者，可減少局部復(fù)發(fā)率及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，提高生存率［10］。目前，對(duì)LARC 行NCRT 療效預(yù)測(cè)的報(bào)道較少，且結(jié)論尚未達(dá)成統(tǒng)一，因此探索并尋找能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)NCRT療效的指標(biāo)以優(yōu)化個(gè)體治療，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。

血清癌胚抗原（CEA）是一種糖蛋白、具有不同糖基化作用的主要腫瘤標(biāo)志物，在直腸癌診斷、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、預(yù)后等方面有著重要的臨床價(jià)值［11］。最近有多項(xiàng)研究針對(duì)血清CEA 水平與腫瘤退縮程度和pCR關(guān)系的進(jìn)行預(yù)測(cè)。Kim等［12］回顧分析117例直腸癌患者發(fā)現(xiàn)，治療前血清CEA水平和組織CEA/GAP?DH 比值與腫瘤退縮程度相關(guān)，CEA 能作為腫瘤對(duì)放化療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Bozkaya等［13］研究結(jié)果表明，新輔助治療前CEA 水平升高（>5 μg/L）的直腸癌患者獲得pCR率較低。此外，Yang等［14］分析了531例接受術(shù)前放化療的直腸癌患者發(fā)現(xiàn)，放化療前CEA降低與較高的pCR 率有明顯的相關(guān)性，且進(jìn)一步分層分析顯示低CEA（≤5 μg/L）與非吸煙患者病理緩解程度密切相關(guān)，而與有吸煙患者無(wú)關(guān)。本研究回顧了98 例LARC 患者NCRT 前血清CEA 的水平以及放化療后腫瘤病理緩解程度，并分析了pCR 與治療前CEA 水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示pCR 組患者的CEA 水平明顯低于非pCR 組。多因素分析發(fā)現(xiàn)，新輔助治療前CEA 水平>5 μg/L 是影響直腸癌pCR 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示CEA升高可能反應(yīng)了腫瘤對(duì)NCRT敏感性較差。CEA 水平高低與NCRT 后腫瘤耐藥性的相關(guān)機(jī)制尚未確定，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行解釋?zhuān)?）CEA 通過(guò)M2 巨噬細(xì)胞刺激GADD45G mRNA 表達(dá)，而GADD45G 是與抗輻射反應(yīng)密切相關(guān)的DNA 損傷反應(yīng)基因［15］。2）有研究表明［16-17］，5-FU 可誘導(dǎo)癌胚抗原在腫瘤細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)，癌胚抗原的過(guò)度表達(dá)通過(guò)阻礙caspase-8 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而降低癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。臨床上，血清CEA 動(dòng)態(tài)檢測(cè)較容易實(shí)現(xiàn)，進(jìn)一步明確新輔助治療前后血清CEA 的水平變化情況與直腸癌放化療反應(yīng)相關(guān)性，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

本研究多因素分析顯示，腫瘤侵犯腸壁周徑（≤1/2）是直腸癌高pCR 率的獨(dú)立影響因素，腫瘤侵犯腸壁周徑程度越低，新輔助治療后出現(xiàn)pCR 的可能性越大。Das等［18］對(duì)562例直腸癌患者的臨床資料進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤侵犯腸壁周徑與pCR 率和腫瘤降期率顯著相關(guān)，且腫瘤侵犯腸壁周徑范圍>50%是低pCR率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。以上結(jié)果均表明，腫瘤侵犯腸壁周徑程度與腫瘤負(fù)荷呈正相關(guān)，比例越小，越容易從NCRT中獲益。

術(shù)前新輔助治療可顯著降低局部復(fù)發(fā)率并且減輕藥物帶來(lái)的不良反應(yīng)。本研究顯示pCR率為19.4%，與既往報(bào)道范圍相一致［13，19］。與有腫瘤殘存的患者相比，術(shù)后獲得pCR的患者OS以及DFS顯著延長(zhǎng)［20］。本研究結(jié)果顯示，98例LARC患者的3年DFS和OS分別為76.2%和90.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［21］。Wasmuth等［22］通過(guò)分析147例NCRT后獲得pCR的LARC的研究發(fā)現(xiàn)，與未獲得pCR的患者相比，其OS明顯提高，可達(dá)87%，局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率均顯著降低。本研究中位隨訪時(shí)間為36個(gè)月，Log-rank檢驗(yàn)顯示pCR組和非pCR組患者、腫瘤反應(yīng)良好（TRG 0～1分）組和腫瘤反應(yīng)不佳（TRG 2～3分）組3年DFS存在顯著性差異，而與3年OS無(wú)關(guān)。

綜上所述，NCRT前血清CEA水平和腫瘤侵犯腸壁周徑程度是直腸腺癌NCRT 后pCR 的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)，可作為預(yù)測(cè)直腸癌NCRT療效的標(biāo)志物。pCR與直腸癌患者高DFS有關(guān)，是影響預(yù)后的因素之一。本研究也存在一定局限性，如樣本量少、隨訪時(shí)間有限以及單中心的回顧性研究，更確切的關(guān)系需要前瞻性、多中心、大樣本研究來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證。