何宗偉，張 敏，李有智，葉忠明，吳建平，劉怡雯，楊丹嬌通信作者

(1.稻城縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，四川 稻城 627750；2.甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所，四川 康定 626000)

0 引言

近幾年發(fā)現(xiàn)，牦牛隨著環(huán)境的惡化，各種疾病的發(fā)病率也隨之增加[1]。其中以牦牛腹瀉最為常見(jiàn)。犢牛腹瀉一直是困擾牦牛養(yǎng)殖業(yè)的重要問(wèn)題[2]。腹瀉是造成犢牦牛生長(zhǎng)發(fā)育不良、死亡的疾病之一，給養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。引起牛腹瀉的常見(jiàn)病毒有牛輪狀病毒(bovinerotavirus，BRV)、牛冠狀病毒(bovinecoronavirus，BccoV)和牛病毒性腹瀉(bovineviraldiarrh-eavirus，BVDV)。有報(bào)道顯示BRV在不同的國(guó)家和地區(qū)均呈現(xiàn)地方性流行[3]。

有近50%的新生犢牛腹瀉與輪狀病毒感染有關(guān)[4]。為調(diào)查稻城牦牛腹瀉病毒BRV感染情況，進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。

1 材料

1.1 樣本采集

試驗(yàn)待檢樣本于2019年5月采自四川省稻城縣5個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的牦牛場(chǎng)。 采樣后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑和主要儀器

試劑：DNA Marker Ⅱ、Marker DL2000(北京天根公司)，2×Taq PCR Master Mix(擎科公司)；RNAiso Plus、PrimeScriptTM等全部從寶生物工程(大連)股份有限公司采購(gòu)。凝膠成像儀(Universal Hood Ⅱ， BIO-RAD公司)，高速離心機(jī)(5801，Eppendorf公司)，電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)，PCR 儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 核酸的提取

樣本送至實(shí)驗(yàn)室后，提取樣本總RNA(根據(jù)Trizol Reagent說(shuō)明書(shū))，隨后進(jìn)行cDNA的合成(按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū))-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 RT-PCR檢測(cè)BRV

檢測(cè)BRV的RT-PCR方法參考周芳等[5]對(duì)牛輪狀病毒RT-PCR的建立方法；所有引物均由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物信息，如表1所示。

表1 BRV檢測(cè)引物

反應(yīng)體系為：2×PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL，dH2O 8.5 μL，總體積25 μL。

3 結(jié)果

RT-PCR檢測(cè)輪狀病毒的電泳結(jié)果顯示：在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳中擴(kuò)增出約230 bp的條帶，為牦牛BRV特異條帶，部分電泳結(jié)果，如圖1所示。

圖1 部分牦牛BRV擴(kuò)增結(jié)果

檢測(cè)結(jié)果：在46分腹瀉糞便樣本中，檢測(cè)出BRV的陽(yáng)性樣本16份，陽(yáng)性率為34.78%。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)稻城縣5個(gè)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的46份不同牦牛糞便樣本進(jìn)行了BRV 感染情況的檢測(cè)，結(jié)果顯示，BRV的陽(yáng)性檢出率為34.78%。該結(jié)果表明稻城縣部分地區(qū)牦牛存在BRV的感染情況，而B(niǎo)RV是嚴(yán)重危害牦牛犢牛健康的一種腹瀉病毒。有調(diào)查顯示，BRV在云南、青海、西藏和四川的牦牛腹瀉樣本的感染率分別為90%、95%、60%和 85.19%，如此高的感染率證明了BRV是引起青藏高原牦牛腹瀉的重要病原[5]。BRV主要感染剛出生的犢牛，BRV感染犢牛機(jī)體后，抵抗力減弱，細(xì)菌在此時(shí)極易侵入機(jī)體，造成感染，加重了病情，導(dǎo)致死亡率升高[4]。犢牦牛腹瀉是臨床上最為常見(jiàn)的多發(fā)病，也是影響犢牦牛存活率的主要因素之一。因此，防治犢牦牛腹瀉變得尤為重要。但到目前為止還沒(méi)有針對(duì)防治牦牛BRV十分可靠、安全的疫苗[6]。

在沒(méi)有特異性疫苗的情況下，應(yīng)該進(jìn)行預(yù)防為主的綜合性預(yù)防措施。具體措施包括：死畜尸體無(wú)害化處理，根除傳染源；消毒徹底，切斷病毒傳播途徑；隔離病畜，積極治療，減少經(jīng)濟(jì)損失；設(shè)置防治組，層層實(shí)行責(zé)任制；加強(qiáng)技術(shù)培訓(xùn)，提高各級(jí)防治隊(duì)伍的技術(shù)水平；進(jìn)行大力宣傳，開(kāi)展群防群治[7]。