郭曉豪，王寒濤，魏鑫，張晶晶，付小康，馬亮，魏恒玲，喻樹迅*

（1. 河南科技學院，河南 新鄉(xiāng)453000；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/ 棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽455000）

棉花是主要的天然纖維作物，每年世界棉花纖維消費量約為2700 萬t[1]，其中陸地棉是種植面積最廣，具有產(chǎn)量高、適應性強的優(yōu)點，占世界棉花產(chǎn)量的95%以上（http://www.cotton.org/）。近年來，紡織技術(shù)的不斷革新和人民生活的不斷提高對纖維品質(zhì)提出了更高的要求，優(yōu)質(zhì)育種顯得尤為重要[2-4]。 因此，在保持高產(chǎn)的基礎(chǔ)上，培育高纖維品質(zhì)的陸地棉品種是擺在育種家面前的重要課題。

纖維品質(zhì)性狀受微效多基因控制，是典型的數(shù)量性狀，傳統(tǒng)的表型選擇在棉花的遺傳改良中發(fā)揮了積極作用。 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過分子標記輔助育種可從分子水平上選擇目標基因，進而實現(xiàn)目標性狀的改良[5-9]。 在棉花纖維品質(zhì)性狀的QTL（Quantitative trait locus, 數(shù)量性狀位點）定位上，前人已經(jīng)開展了較多的研究：伊海法[10]采用優(yōu)質(zhì)母本和高產(chǎn)父本構(gòu)建F2和F2:3群體，利用SSR（Simple sequence repeat，簡單重復序列）標記進行QTL 定位，檢測到35 個與纖維品質(zhì)相關(guān)的QTLs；喬文青等[11]利用纖維品質(zhì)差異顯著的陸地棉親本構(gòu)建F2群體及F2:3群體，以已有的遺傳圖譜為基礎(chǔ)定位到157 個與纖維品質(zhì)有關(guān)的QTLs；Fang 等[12]利用陸地棉重組自交系群體構(gòu)建分子標記連鎖圖，將纖維強度基因定位到62.6 kb 區(qū)間內(nèi)。這些QTLs 的發(fā)現(xiàn)將為后續(xù)的育種工作提供重要的參考。

目前，關(guān)于纖維品質(zhì)QTL 定位的報道不少，定位到的QTLs 很多， 但是借助這些QTLs 開展精細定位仍存在一定的困難，原因在于很少獲得穩(wěn)定的QTLs 區(qū)段。因此，仍然需要在精細定位上做補充， 以及就如何獲得更多更穩(wěn)定的QTLs 進行探索。

本研究利用陸地棉高強纖維品系中棉所679與農(nóng)墾5 號構(gòu)建F2和F2:3群體， 采用雙親間149對多態(tài)性SSR 引物對F2群體進行基因分型，根據(jù)基因型信息，使用QTL IciMapping 軟件構(gòu)建連鎖圖譜，并對纖維長度（Fiber length，F(xiàn)L）、長度整齊度指數(shù) （Uniformity index，UI）、 斷裂比強度（Breaking tenacity，BT）、 馬克隆值（Micronaire，MIC）和斷裂伸長率（Breaking elongation，BE）共5 個纖維品質(zhì)性狀進行QTL 定位。

1 材料與方法

1.1 親本與群體構(gòu)建

以高品質(zhì)陸地棉品種中棉所679（簡稱CCRI 679）與低品質(zhì)材料農(nóng)墾5 號（Nongken 5，簡 稱NK-5）為親本，于2016 年夏天在中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所老所部試驗地（河南省安陽縣）配制雜交組合， 同年冬天在海南自交加代，2017 年4月在老所部試驗地播種親本及F2群體。隨機挑選200 個F2單株在現(xiàn)蕾期取幼葉樣品，于－80 ℃冰箱保存。 7 月份開花期每個單株做20 個自交鈴，10 月軋花收種保存。 2018 年4 月在東場部試驗地種植F2:3家系，每個家系種1 行，2 個重復。 所有群體均設(shè)置4 m 行長，0.8 m 行距，0.25 m 株距。 田間管理與大田生產(chǎn)相同。

1.2 表型檢測

F2自交鈴按單株收獲，F(xiàn)2:3群體每行隨機挑選20 鈴收獲，并分別考種，纖維樣品送原農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心（河南安陽）檢測纖維品質(zhì)，包括前述的5 項指標。

1.3 基因型檢測

雙親及F2單株的DNA 提取采用改良的CTAB（Cetyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨）法[13]。 利用6 688 對SSR 引物在雙親間進行多態(tài)性分析，共得到149 對清晰易辨的多態(tài)性引物，用這些多態(tài)性引物在F2群體間鑒定個體的基因型。 聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）體系與檢測方法參照張軍等[14]的方法。 F2與F2:3家系均基于F2基因型進行QTL 定位。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS 21.0 軟件對F2及F2:3群體表型信息進行描述性統(tǒng)計分析。 使用QTL IciMapping 4.1 軟件[15]分析標記的偏分離情況、根據(jù)F2基因型數(shù)據(jù)繪制連鎖圖譜、根據(jù)圖譜信息和表型數(shù)據(jù)進行QTL 定位。 在冗余標記分析中，設(shè)置缺失率為50%（缺失率高于50%的標記將被刪除），偏分離的閾值設(shè)置為0.01（偏分離檢驗中閾值低于0.01 的標記將被刪除）， 選擇刪除BIN 標記（當多個標記的基因型信息完全一致時， 保留1個標記，刪除冗余標記）；連鎖圖譜構(gòu)建中，設(shè)置連鎖系數(shù)為4.0。 QTL 定位采用加性- 完備區(qū)間作圖法（Inclusive composite interval mappingadditive mapping，ICIM-ADD）， 設(shè)置似然比對數(shù)（Logarithm of odds，LOD）為2.5[16]。 F2:3群體定位以F2基因型為基礎(chǔ)，以F2:3家系2 個重復表型的平均值（如無特殊說明，后文中對F2:3性狀的描述與分析均指2 個重復的平均值）做QTL 定位[17-19]，軟件及方法與F2相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

F2及F2:3群體纖維品質(zhì)性狀的描述性統(tǒng)計見表1。 以均值分析，2 個群體在長度整齊度指數(shù)和馬克隆值上無明顯差異，而在纖維長度、斷裂比強度和斷裂伸長率上存在一定差異。 相比F2群體，F(xiàn)2:3群體纖維長度增加了1.14 mm， 增幅為4.02%；斷裂比強度增加了2.16 cN·tex－1，增幅為7.06%；斷裂伸長率降低了0.99 百分點。 F2:3群體在纖維長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度、馬克隆值的方差均小于F2群體， 表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。 為了進一步了解這些性狀的分布情況，對2個群體的所有性狀繪制了直方圖（圖1）。 在分布上，除了F2馬克隆值與F2:3斷裂伸長率，其余性狀的偏度均在－0.5～0.5， 說明基本服從正態(tài)分布，F(xiàn)2馬克隆值與F2:3斷裂伸長率呈現(xiàn)一定程度的偏態(tài)分布，這可能與受到數(shù)量性狀主效顯性基因的影響有關(guān)。

2.2 連鎖圖譜構(gòu)建

利用6 688 對SSR 引物鑒定雙親之間的多態(tài)性，共得到149 對多態(tài)性引物，多態(tài)性比例為2.23%。 通過對F2群體的基因型檢測， 得到了200 個單株的149 個多態(tài)性位點的基因型數(shù)據(jù)。在繪制連鎖圖譜前， 使用QTL IciMapping 軟件的BIN 功能，對這些標記做進一步篩選：淘汰基因型數(shù)據(jù)完全相同的重復標記和偏分離標記。通過BIN 功能，共刪除11 個冗余標記，8 個偏分離標記。 以130 對多態(tài)性標記構(gòu)建連鎖圖譜，最終得到包含119 個標記、28 個連鎖群、 總長為1 173.5 cM（centiMorgan）的遺傳連鎖圖譜。 其中，最大的連鎖群全長為153.2 cM，包含14 個標記； 最小的連鎖群長為3.3 cM， 包含2 個標記；平均每個連鎖群包含4.25 個標記，標記間平均距離9.86 cM。

2.3 QTL 定位與分析

根據(jù)連鎖圖譜對F2和F2:3群體的5 個纖維品質(zhì)性狀做QTL 定位。 其中，F(xiàn)2群體共檢測到9個QTLs，F(xiàn)2:3群 體 共 檢 測 到11 個QTLs， 這 些QTLs 分布在11 個連鎖群上（表2 和圖2）。 根據(jù)Cotton FGD（http://www.cottonfgd.org/）網(wǎng)站收錄的標記信息以及將標記序列與參考基因組對比的結(jié)果， 其中6 個連鎖群分別錨定到A02、A05、A09、D04、D09 與D11 上；3 個連鎖群確定了染色體編號但無法區(qū)分A、D 亞組：LG1 無法確定在A12 或D12 上，LG2 無法確定在A08 或D08上，LG3 無法確定在A10 或者D10 上；2 個連鎖群LG4 與LG5 未能錨定到染色體。

表1 F2 及F2:3 群體纖維品質(zhì)性狀的描述性統(tǒng)計Table 1 Descriptive statistic characteristics of fiber quality traits in F2 and F2:3 populations

圖1 F2 及F2:3 群體纖維品質(zhì)性狀的分布Fig. 1 The distribution of fiber quality traits in the F2 and F2:3 population

表2 F2 及F2:3 群體纖維品質(zhì)相關(guān)QTL 的定位Table 2 Mapping of QTLs related to fiber quality in F2 and F2:3 populations

共檢測到3 個與纖維長度相關(guān)的QTLs，分布在3 個連鎖群，解釋了6.074 6%～9.795 8%的表型變異。 這些QTLs 的增效基因均來自中棉所679， 這與中棉所679 作為高纖維長度親本相吻合。其中，qFL-D11-1 在F2群體與F2:3群體中均能檢測到，是本研究中僅有的同一性狀在2 個群體中定位到同一區(qū)段的QTL。 除了纖維長度外，F(xiàn)2中斷裂比強度相關(guān)QTL（qBT-D11-1）和F2:3中馬克隆值相關(guān)QTL（qMIC-D11-1）也定位到了該區(qū)段。為了進一步了解該區(qū)段標記在D11 染色體上的物理位置信息， 對4 個緊密連鎖的標記NAU3127、DPL0062、HAU0423、BNL3171 在參考基因組進行比對， 發(fā)現(xiàn)其位置順序與遺傳圖譜相一致， 再次驗證了該區(qū)段內(nèi)標記遺傳位置的可靠性。

共檢測到5 個與長度整齊度指數(shù)相關(guān)的QTLs， 其中F2群體中檢測到1 個，F(xiàn)2:3群體中檢測到4 個。5 個QTLs 分布在5 個不同的連鎖群，解釋了4.829 7%～9.013 3%表型變異，qUI-A05-1解釋表型變異率最大， 其加性效應值為0.168 9。在5 個QTLs 中，F(xiàn)2:3群 體 的 qUI-D04-1 和qUI-L2-1 的增效基因來自親本農(nóng)墾5 號，其余則來自中棉所679。

圖2 連鎖圖譜構(gòu)建與QTL 定位Fig. 2 Linkage map construction and QTL mapping

共檢測到3 個與斷裂比強度相關(guān)的QTLs，3個QTLs 均來自F2群體，分布在3 個不同的連鎖群。 這些QTLs 解釋了5.473 9%～8.065 3%的表型變異， 其中qBT-D09-1 解釋的表型變異率最大，其加性效應值為1.084 0。 3 個斷裂比強度相關(guān)的QTLs 的增效基因均來自于親本中棉所679，這與中棉所679 作為高纖維強度親本相吻合。

共檢測到4 個與馬克隆值相關(guān)的QTLs，其中2 個來自F2群體，2 個來自F2:3群體。 4 個QTLs 分布在3 個連鎖群， 解釋了3.814 6%～10.311 7%表型變異， 其中來自F2:3群體的qMIC-D11-1 解釋的表型變異率最大， 其加性效應 值 為－0.139 8。 4 個QTLs 中，F(xiàn)2群 體 的qMIC-D11-1 與F2:3群體的qMIC-D11-1 的增效基因來自于親本農(nóng)墾5 號，其余來自中棉所679。

共檢測到4 個與斷裂伸長率相關(guān)的QTLs，其中1 個來自F2群體，3 個來自F2:3群體。 4 個QTLs 分布在4 個不同的連鎖群，解釋了7.1335%～8.784 9%的表型變異， 其中來自F2:3群體的qBE-L4-1 解釋的表型變異率最大，其加性效應值為－0.148 7。 4 個QTLs 中， 只 有F2群 體 的qBE-A02-1 的增效基因來自親本中棉所679，其余來自農(nóng)墾5 號。

3 討論

3.1 QTL 位點的穩(wěn)定性

對比前人研究，在李超[20]等陸海雜交群體的纖維品質(zhì)定位中，2 個與本研究共有的標記NAU5046 與NAU5128 分別被定位到D04 與D08 染 色 體 上；Wang 等[21]利 用 陸 地 棉RIL 群 體在標記NAU3127 和DPL0062 間鑒定到了1 個纖維長度QTL 和1 個馬克隆值QTL。 本研究也在這2 個標記間鑒定到了這2 個纖維品質(zhì)性狀相關(guān)QTLs，且纖維長度QTL 在F2和F2:3群體中均能檢測到，再次驗證了NAU3127 和BNL3171間QTLs 的可靠性。其余QTLs 未見前人報道。不同研究中定位到的QTLs 存在難以相互借鑒的現(xiàn)象。 一方面在于目前已經(jīng)開發(fā)的分子標記種類繁多且數(shù)量巨大，單一研究中用到的分子標記數(shù)量有限；其二是不同親本、不同環(huán)境對QTL 定位影響較大；其三在于不同研究中連鎖圖譜覆蓋基因組的比例和位置不同， 由此鑒定出QTLs 區(qū)段也不同。

3.2 QTL 成簇分布

多個不同性狀或者不同世代的同一性狀定位到同一個標記區(qū)間內(nèi)，說明可能存在基因連鎖或者一因多效的現(xiàn)象。 這種現(xiàn)象在不同作物、不同群體、不同環(huán)境中均有存在。楊繼龍等[22]在棉花早熟和纖維品質(zhì)的研究中檢測到5 個與標記CGR6764a 連鎖的QTLs，這些QTLs 與4 個性狀相關(guān)， 另外在連鎖群LG2 的NAU5189 和NAU3377b 之間檢測到4 個控制不同性狀的QTLs；李帥陽等[23]在纖維品質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)7 個QTLs 聚集在LG17 上32 cM 內(nèi)，6 個QTLs 聚集在LG52 上23 cM 內(nèi)。本研究也發(fā)現(xiàn)了QTL 成簇分布的現(xiàn)象， 尤其是在F2群體定位到的9 個QTLs， 有7 個 成 簇 存 在， 其 中qFL-A02-1、qBT-A02-1 和qBE-A02-1 聚集在標記BNL3545、NAU3903 之間，qUI-D09-1 和qBT-D09-1 聚集在標記CGR6692、NAU3915 之間，qFL-D11-1 和qBTD11-1 聚集在標記DPL0062、HAU0423 之間。

3.3 多態(tài)性標記的數(shù)量

本試驗從6 688 對SSR 引物中得到了149對多態(tài)性標記，多態(tài)率為2.23%，低于陸地棉種內(nèi)一般為4.13%～7.9%的多態(tài)性水平[24-25]。 錨定在連鎖圖譜上的多態(tài)性標記也偏少， 為119 個，這可能與篩選多態(tài)性標記時采取了嚴苛的質(zhì)量控制有關(guān)，淘汰了大量清晰度較低、基因型缺失較多的標記。 另外，在篩選到的149 對多態(tài)性標記中， 刪除了11 個群體基因型相同的標記和8 個偏分離標記。 群體基因型信息完全相同的標記可能受到連鎖累贅的影響，導致區(qū)段內(nèi)沒有交換單株存在。 連鎖圖譜構(gòu)建中經(jīng)常出現(xiàn)偏分離標記，偏分離影響標記的重組值及排列順序[26-28]，進而影響QTL 定位的結(jié)果。 本試驗為規(guī)避這一影響構(gòu)圖前去除偏分離標記。

3.4 標記在染色體上的分布

在本試驗中有3 個連鎖群確定了染色體編號，但難以區(qū)分是在哪個亞組，還有2 個連鎖群未能錨定到染色體。 原因在于這些連鎖群中的SSR 標記在參考基因組序列的2 個亞組間均有發(fā)現(xiàn)， 甚至有些標記不僅出現(xiàn)在不同亞組間，還出現(xiàn)在了不同染色體上，因此，辨識這些標記的染色體位置便變得非常困難。 這也再次說明了A、D 亞組間的部分同源性， 不同染色體間的DNA 序列也存在一定的相似性。 這種相似性增加了區(qū)分標記位置的難度，也給將連鎖圖譜與物理圖譜相結(jié)合的研究方法帶來了困難。 因此，如何能在保證擁有足夠多態(tài)性標記的基礎(chǔ)上，使用專一性更強的標記，將是解決連鎖圖譜與物理圖譜難以建立聯(lián)系的關(guān)鍵。

4 結(jié)論

本研究利用F2與F2:3群體定位纖維品質(zhì)形狀QTL，從6 688 對SSR 引物中得到了149 對多態(tài)性標記，通過對標記的進一步篩選，構(gòu)建了包含28 個連鎖群、119 個標記、 總長為1 173.5 cM的遺傳連鎖圖譜。 根據(jù)連鎖圖譜進行QTL 定位，共得到20 個QTLs， 其中在F2群體中得到9 個QTLs， 在F2:3群體中得到11 個QTLs。 其中，qFL-D11-1 在2 個世代中均能檢測到。 發(fā)現(xiàn)存在多個QTLs 聚集在同一標記區(qū)間的現(xiàn)象， 說明控制不同性狀的QTL 可能成簇存在。 利用多世代群體進行QTL 定位有助于發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定可靠的QTL位點。 該研究將為以后挖掘纖維品質(zhì)性狀相關(guān)基因及分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。