龐淇丹 王天然 肖 猱

(首都醫(yī)科大學藥學院化學生物學系， 北京 100069)

在必需金屬離子中，銅是繼鐵和鋅之后的第三大微量元素。Cu2+在日常生活中廣泛應(yīng)用，使得Cu2+成為常見的金屬污染物。Cu2+過載可能導(dǎo)致嚴重的疾病，如貧血、朊病毒病、阿爾茨海默癥、印度兒童肝硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化癥以及門克斯病和威爾遜病[1-2]。因二價銅離子在人體中的重要作用而更引起人們廣泛關(guān)注?？紤]到Cu2+離子的重要性，開發(fā)出在水溶液中用于檢測Cu2+離子的探針分子已成為一個重要的研究課題。硫化氫(H2S)是一種無色易燃且具有刺鼻臭雞蛋味的氣體，是僅次于一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)的第三大內(nèi)源性氣體信號分子。H2S可滲入細胞膜從而阻礙細胞正常呼吸。人體長期暴露在充滿H2S氣體的環(huán)境中會導(dǎo)致嗅覺失靈，意識模糊，嚴重者甚至失去生命體征。體內(nèi)H2S濃度過高會導(dǎo)致阿爾茨海默病、糖尿病、唐氏綜合征、帕金森病和高血壓等，這使得H2S成為診斷和治療以上疾病的潛在目標分子[3-4]。因此，研制一種對硫化氫具有高選擇性和高靈敏度的探針分子，并應(yīng)用于檢測生物樣品具有現(xiàn)實科研意義。在常見的多種生物成分檢測方法中，熒光傳感法效果優(yōu)異。熒光探針具備選擇性好、靈敏度高、操作簡單等諸多優(yōu)點[5-7]。部分熒光探針分子可依次檢測銅離子及硫化氫分子，這主要是由于硫離子與金屬銅離子結(jié)合能力較強，硫化氫在溶液體系中可奪取“探針-銅”配合物中的銅離子，生成硫化銅而釋放探針分子，實現(xiàn)“OFF-ON-OFF”型熒光響應(yīng)。

銥(Ⅱ)配合物因其具備光穩(wěn)定性好、光學壽命長、量子產(chǎn)率高和斯托克斯位移大等優(yōu)異的光化學及光物理性質(zhì)，已成為一類重要的熒光探針分子。通過修飾銥配合物配體結(jié)構(gòu)可獲得豐富的細胞靶向配合物及生物探針分子，部分結(jié)構(gòu)已被成功運用于生物識別及顯像領(lǐng)域中[8-9]。筆者設(shè)計并制備了一個被1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(輪環(huán)藤寧, cyc)功能化的新型銥配合物探針分子Ir-cyc。銥配合物作為熒光發(fā)色團，氮雜大環(huán)化合物cyc為金屬銅離子螯合基團，cyc與銅離子結(jié)合后致使發(fā)色團上的電子部分轉(zhuǎn)移至cyc環(huán)，以致發(fā)色團熒光被削弱。因銅離子與cyc的結(jié)合能力較強，H2S不能從雙核金屬配合物中奪走銅離子而釋放出Ir-cyc，加之硫離子的重原子效應(yīng)使雙核金屬配合物由Ir-cyc-Cu變?yōu)镮r-cyc-CuS，熒光進一步猝滅以致消失。因此，筆者所設(shè)計探針分子可在水性溶液中依次識別Cu2+和H2S，表現(xiàn)出“ON-OFF-OFF”熒光依次猝滅響應(yīng)而并非傳統(tǒng)的“OFF-ON-OFF”型熒光探針。Ir-cyc為一個銅離子探針，與銅離子螯合后的雙核銥(Ⅲ)-銅(Ⅱ)配合物熒光探針I(yè)r-cyc-Cu可作為硫化氫分子探針，這個新探針具備應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測及生物樣品分析的潛力。

1 材料與方法

1. 1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

三重四極桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自美國沃特世公司，SHIMADZU UV-2600型紫外分光光度計購自日本島津公司，WFH-204B型手提式紫外燈購自上海精科實業(yè)有限公司，HITACHI F-2500型熒光分光光度計購自日本日立公司。

1.1.2 試劑

溴乙酰溴、2-苯基吡啶(2-phenylpyridine, ppy)、1,10-菲羅啉-5-氨基(Phen-NH2)、cyc及硫氫化鈉(NaHS)等試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。2-乙氧基乙醇及六氟銻酸銀(AgSbF6)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。三水合氯化銥(IrCl3·3H2O)購自北京華威銳科化工有限公司。甲醇(MeOH)、乙腈(MeCN)、二氯甲烷(CH2Cl2)、三乙胺(Et3N)、四氫呋喃(THF)、碳酸鉀(K2CO3)及五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)等試劑購自北京伊諾凱科技有限公司。實驗過程所用水為去離子水。

1.2 化合物的合成

銥配合物Ir-cyc的制備包括4步：首先是利用親核取代反應(yīng)合成溴功能化的配體分子Phen-Br，這一步反應(yīng)的原料Phen-NH2和溴乙酰溴；隨后以ppy和IrCl3·3H2O為原料在2-乙氧基乙醇水溶液中回流制備氯橋式銥二聚體[Ir(ppy)2Cl]2；第三步反應(yīng)利用前兩部制得的[Ir(ppy)2Cl]2和Phen-Br，通過螯合反應(yīng)制備了溴功能化的銥配合物Ir-Br；最后，利用Ir-Br與輪環(huán)藤寧間的親核取代反應(yīng)制備了銥配合物探針分子Ir-cyc。

1.2.1 合成溴功能化的菲羅啉配體[2-bromo-N-(1,10-phenanthrolin-5-yl)acetamide hydrobromide, Phen-Br]

Phen-Br的合成路線參照了Belhadj等[10]和Bos等[11]報道的方法并做了適當調(diào)整。將1,10-菲羅啉-5-胺(195.2 mg, 1.0 mmol)置于50 mL圓底燒瓶中，向其中入四氫呋喃 (30 mL)和三乙胺 (101.2 mg, 1.0 mmol)，攪拌30 min使其成透明溶液。將混合物置于冰域中冷卻至0 °C后，逐滴加入溶于5 mL四氫呋喃的2-溴代乙酰溴(302.9 mg, 1.5 mmol)，反應(yīng)液逐漸渾濁。在室溫下攪拌反應(yīng)12 h后過濾。用甲醇淋洗濾渣后干燥產(chǎn)物。

1.2.2 制備氯橋二聚體銥前配物{(ppy)2Ir(μ-Cl)2Ir(ppy)2, [Ir(ppy)2Cl]2}

[Ir(ppy)2Cl]2的制備方法參照了Sprouse等[12]報道的方法并做了適當調(diào)整。圓底燒瓶中依次加入IrCl3·3H2O (1.06 g, 3.01 mmol)與2.2當量的配體2-苯基吡啶(1.03 g，6.65 mmol)，接著添加15 mL的2-乙氧基乙醇和5 mL的去離子水。將混合反應(yīng)物加熱回流16 h后有沉淀出現(xiàn)，混合物冷卻后再向其中加入50 mL的去離子水沉淀產(chǎn)物，將沉淀產(chǎn)物過濾后依次用水和MeOH/H2O (1∶1)洗滌。最后將產(chǎn)物干燥后得終產(chǎn)物[Ir(ppy)2Cl]2。

1.2.3 合成溴功能化的銥配合物{[Ir(ppy)2(Phen-Br)](SbF6), Ir-Br}

溴功能化的銥配合物Ir-Br的制備路線參照了Schmittel等[13]和Lu等[14]報道的方法并做了適當調(diào)整。將[Ir(ppy)2Cl]2(107.2 mg, 0.1 mmol), Phen-Br (63.2 mg, 0.2 mmol)和六氟銻酸銀AgSbF6(68.7 mg, 0.2 mmol)混合溶解于30 mL甲醇/二氯甲烷(1∶1)溶液中攪拌，體系回流反應(yīng)12 h后溶液呈棕黃色且變渾濁。冷卻反應(yīng)體系至室溫，用濾紙過濾以除去不溶物氯化銀。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液蒸干，以少量二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物，并以二氯甲烷/丙酮(1∶1)為洗脫劑，用填有硅膠(SiO2)的柱層析分離純化產(chǎn)物。

1.2.4 合成銥終配物{[Ir(ppy)2(Phen-cyc)](SbF6), Ir-cyc}

輪環(huán)藤寧功能化的銥配合物Ir-cyc的制備路線參照了Ye等[15]和Zhang等[16]報道的方法并做了適當調(diào)整。向50 mL圓底燒瓶中加入乙腈(20 mL)、Ir-Br (52.6 mg, 0.05 mmol)、輪環(huán)藤寧(17.2 mg, 0.1 mmol)和無水碳酸鉀(6.9 mg, 0.05 mmol)等試劑，攪拌使反應(yīng)體系混合均勻并在回流的條件下反應(yīng)6 h后停止加熱。反應(yīng)液冷卻至室溫后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去有機溶劑，粗產(chǎn)物用柱層析方法純化，所用洗脫劑為CH3CN-H2O-KNO3飽和水溶液 (100∶15∶1)。收集含有目標產(chǎn)物的餾分，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。將所得固體溶于干燥乙腈中，以填有棉花的玻璃滴管為過濾裝置，過濾除去多余硝酸鉀固體，旋干乙腈后得到固體Ir-cyc。

1.3 ESI-MS檢測

在檢測ESI-MS前，所有待測樣品均以少量DMSO完全溶解，隨后以甲醇或水稀釋至適當濃度待測。

2 結(jié)果

2.1 銥配合物探針分子的制備

新型銥配合物探針分子的制備詳見圖1。配體分子Phen-Br、氯橋二聚體銥前配物[Ir(ppy)2Cl]2、溴功能化的銥配合物Ir-Br及銥終配物Ir-cyc被依次制備。

圖1 [Ir(ppy)2Cl]2，Phen-Br，Ir-Br和Ir-cyc的合成Fig.1 Synthesis of [Ir(ppy)2Cl]2, Phen-Br, Ir-Br, and Ir-cyc

2.2 基于電噴霧電離質(zhì)譜ESI-MS法確定配體及配合物結(jié)構(gòu)

實驗合成得到248.2 mg Phen-Br黃色固體，產(chǎn)率：78.5%。ESI-MS(m/z): 315.6[Phen-Br+H+]+與其被質(zhì)子離子化后的理論值C14H11BrN3O+([Phen-Br + H+]+): 316.0相符。Phen-NH2與溴乙酰溴間所發(fā)生的親核反應(yīng)是制備Phen-Br的有效方法。ESI-MS譜圖詳見圖2。

圖2 Phen-Br在正離子模式下的ESI-MS譜圖Fig.2 ESI-MS spectrum of Phen-Br in positive mode

實驗制備得到1.11 g黃色配合物粉末[Ir(ppy)2Cl]2，產(chǎn)率：69.0%。ESI-MS (m/z): 500.7為[Ir(ppy)2]2+(C22H16IrN22+)的實測值與其理論值501.1接近; 536.8為[Ir(ppy)2Cl2]2+(C44H32Cl2Ir2N42+)的質(zhì)核比實測數(shù)值，其理論值為536.1，以上兩個實測信號均與理論值相符，顯示高純度[Ir(ppy)2Cl]2已被成功制備。ESI-MS譜圖詳見圖3。

圖3 [Ir(ppy)2Cl]2在正離子模式下的ESI-MS譜圖Fig.3 ESI-MS spectrum of [Ir(ppy)2Cl]2 in positive mode

實驗制得91.8 mg黃色固體Ir-Br，產(chǎn)率：43.6%。ESI-MS (m/z): 815.8 [Ir-Br]+， 與C36H26BrIrN5O+的理論值816.1基本相符。ESI-MS譜圖詳見圖4。

圖4 Ir-Br在正離子模式下的ESI-MS譜圖Fig.4 ESI-MS spectrum of Ir-Br in positive mode

實驗制得20.1 mg黃色固體Ir-cyc，產(chǎn)率：35.1%。ESI-MS (m/z): 454.1 [Ir-cyc+H+]2+與其捕獲一個質(zhì)子產(chǎn)生的理論值C44H46IrN9O2+[Ir-cyc+H+]2+)454.7接近，Ir-cyc制備成功，ESI-MS譜圖詳見圖5。

圖5 Ir-cyc在正離子模式下的ESI-MS譜圖Fig.5 ESI-MS spectrum of Ir-cyc in positive mode

Ir-cyc與Cu2+螯合后所生成的Ir-cyc-Cu在正離子模式下的ESI-MS譜圖銥配合物Ir-cyc與Cu2+反應(yīng)后所生成螯合物的ESI-MS信號峰所顯示的質(zhì)量電荷比數(shù)值為242.0，這一實驗值與[Ir-cyc-Cu + H+]4+的質(zhì)量電荷比理論數(shù)值(C44H46CuIrN9O4+242.6)相吻合，這說明Cu2+已與輪環(huán)藤寧螯合，且這一配位化合物在電噴霧室足夠穩(wěn)定不易被碎片化。另一方面，離子化的配合物帶4個正電荷，這說明Cu2+與輪環(huán)藤寧配位時3個亞氨基(-NH-)未失去H原子，Cu2+與N原子間形成的鍵為金屬配位鍵而非金屬有機鍵，詳見圖6。

圖6 Ir-cyc與Cu2+螯合后所生成的Ir-cyc-Cu在正離子模式下的ESI-MS譜圖Fig.6 ESI-MS spectrum in positive ion mode of Ir-cyc-Cu generated by chelation of Ir-cyc with Cu2+

2.3 銥配合物的光譜性質(zhì)

Ir-cyc在水溶液中的紫外-可見光吸收和熒光光譜，Ir-cyc在水溶液中被365 nm激發(fā)光照射所發(fā)光的色度圖，向Ir-cyc水溶液中依次加入Cu2+和NaHS后的熒光光譜變化，詳見圖7、8、9。圖7為銥配合物Ir-cyc在含DMSO的水溶液中所顯示的紫外-可見光吸收和發(fā)光光譜。Ir-cyc在波長為220～350 nm處有強烈的吸收，而在350～440 nm處吸收較弱。高能帶很可能是以配體為中心的(LC)π→π*躍遷，低能吸收帶主要是由于單線態(tài)及三線態(tài)金屬到配體荷移躍遷(1MLCT和3MLCT)共同作用所產(chǎn)生。常溫下，此溶液在波長為365 nm的激發(fā)光照射下，呈現(xiàn)出以580 nm 為中心的橙色發(fā)光譜線，這是3MLCT的發(fā)射態(tài)。為直觀的表示銥配合物Ir-cyc的熒光特征，基于圖7所示熒光譜線，利用軟件CIE1931 Chromaticity Coordinate Calculation計算其色度坐標為：x=0.449,y=0.473(圖8)。Ir-cyc在色度圖中所示的顏色與其在紫外燈下顏色一致(圖9)。Ir-cyc在水溶液中所顯示的紫外-可見光吸收和發(fā)光光譜與類似銥配合物的光譜性質(zhì)相似。

圖7 Ir-cyc在水溶液中的紫外-可見光吸收和熒光光譜(激發(fā)光波長為365 nm)Fig.7 UV-vis absorption and fluorescence spectrum (λex=365 nn) of Ir-cyc in aqueous solution

圖8 Ir-cyc在水溶液中被365 nm激發(fā)光照射所發(fā)光的色度圖[CIE (1931)]Fig.8 CIE (1931) chromaticity diagram for Ir-cyc in aqueous solution (λex =365 nm)

圖9 向Ir-cyc水溶液中依次加入Cu2+和NaHS后得熒光光譜變化Fig.9 Fluorescence spectra of probe Ir-cyc with the incremental addition of Cu2+ and NaHS in aqueous solution

如圖9所示，向Ir-cyc中加入過量Cu2+后，熒光強度大幅減弱，但熒光信號并未消失，在波長為580 nm 處仍可見到熒光響應(yīng)。這一結(jié)果說明Ir-cyc可通過熒光猝滅識別為Cu2+，其產(chǎn)物Ir-cyc-Cu帶有弱黃色熒光。隨后，將NaHS水溶液逐漸加入到Ir-cyc-Cu體系中，熒光逐漸減弱以致消失，并未出現(xiàn)熒光回升現(xiàn)象，這一現(xiàn)象說明體系內(nèi)所生成的CuS未脫離輪環(huán)藤寧環(huán)，而是以Ir-cyc-CuS形式存在(圖10)。這一發(fā)現(xiàn)有利于使雙核金屬配合物Ir-cyc-Cu作為硫化氫分子探針而繼續(xù)被深入研究。

圖10 銥探針分子Ir-cyc依次識別Cu2+和H2S的反應(yīng)機制Fig.10 The sensing mechanism of probe Ir-cyc for Cu2+ and H2S

2.4 反應(yīng)機制

銥探針分子依次識別Cu2+和H2S的反應(yīng)機制詳見圖10。cyc為Cu2+的強螯合劑，他們所形成的絡(luò)合物和進一步捕獲溶液中的Cu2+離子，從而形成惰性雙金屬配合物Ir-cyc-CuS。

3 討論

環(huán)金屬銥配合物是由中心銥原子與碳原子或氮原子間的銥-碳金屬有機鍵和銥-氮配位鍵形成環(huán)狀配位化合物。經(jīng)歷近四十年的發(fā)展，正一價離子型銥配合物的合成方法已逐漸成熟，主要包括以下4種方法：第一，King等[17]在1985年首次以2-苯基吡啶(ppy)為配體與水合三氯化銥反應(yīng)，報道了Ir(ppy)3的合成方法，但產(chǎn)率較低；第二，Dedeian等[18]在1991年改善了第一種方法，以三(乙酰丙酮根)合銥(Ⅲ)[Ir(acac)3]為原料與ppy反應(yīng)制備Ir(ppy)3，該方法所制備的產(chǎn)物產(chǎn)率較高，但原料Ir(acac)3價格較高，而且這種方法主要適用于銥的均配物的制備；第三，Colombo等[19]在1994年報道了以氯橋式銥二聚體[Ir(ppy)2Cl]2為原料，其與過量配體分子反應(yīng)能得到高產(chǎn)率的銥配合物，而且既可以得到銥的均配物也可制得銥的雜配物；第四，1994年Schmid等[20]基于[Ir(ppy)2Cl]2與三氟甲烷磺酸銀(AgOTf)在乙腈溶劑中回流反應(yīng)制備了含乙腈的銥前配物，該配合物可在較溫和的條件下與配體分子反應(yīng)制備新型銥配合物，但該方法所含步驟較多。綜合以上方法的優(yōu)缺點，筆者以第三種經(jīng)典方法制備了新型銥配合物Ir-cyc?；谟H核取代反應(yīng)和螯合反應(yīng)，完整報道了銥配合物探針分子的制備方法。

ESI-MS法具有高靈敏度、高精確度及響應(yīng)及時等優(yōu)點，以微量樣品注射器將待測樣品注入電噴霧室，離子化的樣品分子和碎片離子經(jīng)過一系列分離后進入質(zhì)量分析系統(tǒng)。電離后的分子大多帶有單電荷，有時也帶有多電荷，ESI-MS信號為樣品組分的質(zhì)量電荷比(m/z)。因此，即便是測試高純度化合物，所測得的譜圖也可產(chǎn)生多組分信號峰，這有益于研究者從多角度分析所合成產(chǎn)物生成與否。ESI-MS法可實時測試反應(yīng)液，這種方法可與薄層色譜法綜合運用考察原料消耗及產(chǎn)物生成情況，定性分析反應(yīng)進展。ESI-MS數(shù)據(jù)及譜圖已成為評價新產(chǎn)物的必要資料。氯橋式銥配合物二聚體[Ir(ppy)2Cl]2有兩個ESI-MS信號，與理論值相符的數(shù)據(jù)Ir3+與C元素之間所形成的鍵為金屬有機鍵，可消耗Ir3+的一個正電荷，而Ir3+與N或Cl間所形成的鍵為金屬配位鍵，不消耗Ir3+的正電荷。在電離過程中，橋式結(jié)構(gòu)容易從Ir-Cl處斷裂，這也說明Ir與C及N的鍵合力強于與Cl的鍵合力。溴功能化的銥配合物Ir-Br實測數(shù)值與[Ir-Br]+的理論數(shù)值基本相同。此結(jié)果一方面證實Ir-Br已被成功制備，另一方面說明Ir-Br為+1價態(tài)，實際結(jié)構(gòu)與理論結(jié)構(gòu)相符。輪環(huán)藤寧修飾的銥配合物Ir-cyc顯示的質(zhì)量電荷比數(shù)值，這與其捕獲一個質(zhì)子所產(chǎn)生的理論數(shù)據(jù)相符，這一結(jié)果也證明Ir-cyc已被成功制備。

本文中所合成的化合物(Phen-Br)、單電荷銥配合物及多電荷銥配合物([Ir(ppy)2Cl]2、Ir-Br、Ir-cyc及Ir-cyc)均已通過ESI-MS譜圖中的質(zhì)量電荷比(m/z)證實。在電噴霧電離質(zhì)譜測試過程中，有機配體分子以單電荷形式出現(xiàn)，銥配合物分子既有以單電荷形式出現(xiàn)也有以雙電荷形式出現(xiàn)，而銥-銅雙金屬配合物Ir-cyc-Cu以四電荷出現(xiàn)。本研究豐富了銥配合物分子種類，為制備多功能化銥配合物分子提供了可參考的路線和數(shù)據(jù)。

銥探針分子Ir-cyc在水溶液中有明顯的紫外-可見光吸收，在365 nm紫外光照射下顯黃色，其色度圖坐標為(0.449, 0.473)。Ir-cyc在水溶液中可通過熒光猝滅效應(yīng)依次識別Cu2+和H2S，實現(xiàn)熒光“ON-OFF-OFF”響應(yīng)，這證實本文設(shè)計并制備的銥配合物Ir-cyc可作為銅離子探針，其銅配合物Ir-cyc-Cu可作為硫化氫探針，這兩個新分子具備應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測及生物樣品分析的潛力。