李露壯，姜衍，徐愛華，辛昊，王京楊，孫永新

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第一醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科；2.附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽 110001；3.口腔醫(yī)學(xué)專業(yè)102期，沈陽 110122）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow messenchymal stem cell，BMSC）是從骨髓中分離出的具有強(qiáng)大增殖和分化能力的多能干細(xì)胞［1］。近年來，BMSC廣泛用于治療骨骼肌肉疾病，包括骨與肌腱軟骨再生和骨不連等。由于病變組織局部活性氧增加及清除失衡［2］而產(chǎn)生氧化應(yīng)激微環(huán)境，導(dǎo)致細(xì)胞在移植后大量死亡，從而極大影響了疾病預(yù)后。因此，探索移植后BMSC抗氧化應(yīng)激和抗凋亡的方法，是促進(jìn)BMSC移植后存活的關(guān)鍵［3］。蝦青素是一種安全無毒的脂溶性、橙紅色類胡蘿卜素，在生物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種作用［4］。氧化應(yīng)激可能通過核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化響應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［5-6］。

本研究采用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)BMSC建立氧化應(yīng)激模型，通過檢測細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malonyldialdehyde，MDA）含量及Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的改變，探討蝦青素對體外BMSC氧化應(yīng)激模型的預(yù)保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人BMSC細(xì)胞株（中國科學(xué)院細(xì)胞庫）。

1.1.2 試劑：蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品、CCK-8檢測試劑、MDA檢測試劑盒、SOD檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒、30%H2O2溶液、ECL顯影液（北京索萊寶公司）；二甲基亞砜（美國Sigma公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胰蛋白酶（中國Genview公司）；胎牛血清（中國四季青公司）；Nrf2抗體、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）抗體、還原型輔酶/醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）抗體（美國ABclonal公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（中國諾唯贊公司）。

1.1.3 儀器與設(shè)備：CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀（美國Therom公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；臺式高速低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；顯微鏡（日本Nikon公司）；25 cm2培養(yǎng)瓶、6 cm培養(yǎng)皿、6孔板、96孔板（澳大利亞BEAVER公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將人BMSC接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞生長到80%～90%融合時(shí)傳代，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)：

1.2.2.1 建立H2O2誘導(dǎo)的BMSC氧化應(yīng)激模型 將培養(yǎng)的BMSC以1×104/mL的密度接種于96孔板，每孔180 μL，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，分別用0、100、200、300、400、500、600 μmol/L的H2O2溶液處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。處理24 h后CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，吸去舊培養(yǎng)液，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的吸光值。

1.2.2.2 蝦青素預(yù)保護(hù)BMSC的最佳濃度范圍 將培養(yǎng)的BMSC接種于96孔板，分別用含0、12.5、25、50、100、200、400、800、1 600、3 200 μmol/L的蝦青素培養(yǎng)液處理，24 h后CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，方法同1.2.2.1。確定蝦青素預(yù)保護(hù)最佳濃度范圍。

1.2.2.3 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的BMSC氧化應(yīng)激的保護(hù)作用 將培養(yǎng)的BMSC接種于96孔板，分別用0、25、50、100、200 μmol/L的蝦青素預(yù)保護(hù)2 h，之后用500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，方法同1.2.2.1。對照組（0 μmol/L）細(xì)胞存活率設(shè)為100%，細(xì)胞存活率（%）=（A加藥組-A空白）/（A對照組-A空白）×100。

1.2.3 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性檢測：BMSC接種于6孔板，密度為1×105/mL，細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后，分為對照組、蝦青素組、H2O2組、蝦青素+H2O2組。蝦青素組使用200 μmol/L蝦青素溶液處理BMSC 2 h，H2O2組使用500 μmol/L H2O2溶液誘導(dǎo)BMSC 24 h，蝦青素+H2O2組使用200 μmol/L蝦青素預(yù)保護(hù)BMSC 2 h后再使用500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h。細(xì)胞消化后1 000 r/min低速離心，收集細(xì)胞沉淀，加入提取液，超聲震碎細(xì)胞，8 000g、4 ℃離心10 min。根據(jù)試劑盒說明書，分別檢測細(xì)胞SOD活性和GSH含量。細(xì)胞消化后，收集細(xì)胞沉淀，加入3倍沉淀體積的提取液重懸細(xì)胞，反復(fù)凍融2～3次，8 000g、4 ℃離心10 min，收集上清，根據(jù)試劑盒說明書檢測MDA含量。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測：BMSC接種于6 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞分組同1.2.3。收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS沖洗2次，1 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，300g離心10 min，棄上清，用1 mL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1×106/mL。取流式測定管，每管加100 μL細(xì)胞溶液，再加入5 μL Annexin V-FITC，避光室溫染色10 min，再加入5 μL碘化丙啶，避光室溫孵育5 min，加PBS至500 μL，1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀上檢測，應(yīng)用Flowjo10軟件分析。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Western blotting：細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，細(xì)胞分組同1.2.3。用預(yù)冷的PBS清洗3次，冰上加蛋白裂解液RIPA，用清潔的細(xì)胞刮收集細(xì)胞，4 ℃、12 000g離心15 min，收集上清，置于冰上待用。BCA試劑盒測定蛋白濃度。調(diào)節(jié)蛋白濃度，制備10%分離膠、5%濃縮膠，SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白封閉1 h。TBST搖床洗膜3次后，一抗孵育。一抗為兔源Nrf2抗體（1∶2 000稀釋）、兔源HO-1抗體（1∶1 500稀釋）、兔源NQO1抗體（1∶1 500稀釋），4 ℃過夜。TBST搖床洗膜3次后，加入二抗室溫孵育1 h，二抗為羊抗兔IgG（1∶5 000稀釋）。電化學(xué)發(fā)光顯影，應(yīng)用Image J軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蝦青素預(yù)保護(hù)對H2O2誘導(dǎo)的BMSC存活率的影響

2.1.1 H2O2誘導(dǎo)BMSC建立氧化應(yīng)激模型：BMSC經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后，細(xì)胞存活率明顯下降，呈濃度依賴性，H2O2濃度越大，細(xì)胞存活率越低（圖1A），且存活率隨H2O2誘導(dǎo)時(shí)間延長而下降（圖1B）。500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h時(shí)，細(xì)胞存活率約為對照組的50%～60%（P＜ 0.05）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇500 μmol/L H2O2誘導(dǎo)24 h建立H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型。

圖1 建立H2O2誘導(dǎo)的BMSC氧化應(yīng)激模型Fig.1 Model of H2O2-induced oxidative stress in BMSCs

2.1.2 蝦青素預(yù)保護(hù)細(xì)胞最適濃度范圍：用0～3 200 μmol/L的蝦青素溶液處理BMSC 24 h，采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果表明，25～200 μmol/L的蝦青素濃度為安全處理范圍，與對照組相比，BMSC存活率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。確定蝦青素預(yù)保護(hù)最適濃度范圍為25～200 μmol/L。見圖2。

2.1.3 蝦青素預(yù)保護(hù)提高H2O2誘導(dǎo)的BMSC存活率：選取最適濃度范圍（25、50、100、200 μmol/L）的蝦青素預(yù)保護(hù)2 h，之后用500 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)24 h。結(jié)果顯示，不同濃度的蝦青素預(yù)保護(hù)組與H2O2組比較，BMSC的存活率均明顯升高（P＜ 0.05）；200 μmol/L蝦青素預(yù)保護(hù)組與H2O2組比較，BMSC的存活率明顯升高（P＜ 0.05）。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，也證實(shí)200 μmol/L蝦青素預(yù)保護(hù)組BMSC存活率最高，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇200 μmol/L濃度作為預(yù)保護(hù)濃度。見圖3。

圖2 不同濃度蝦青素對BMSC存活率的影響Fig.2 Viability of BMSCs treated with varying concentrations of astaxanthin

2.2 氧化應(yīng)激相關(guān)酶活性的檢測

圖3 蝦青素預(yù)保護(hù)對H2O2誘導(dǎo)的BMSC存活率的影響Fig.3 Effect of astaxanthin pretreatment on the viability of BMSCs subjected to H2O2-induced oxidative stress

結(jié)果顯示，H2O2組的SOD活性和GSH含量較對照組下降（P＜ 0.05），MDA含量較對照組明顯升高（P＜0.05）；蝦青素+H2O2組SOD活性和GSH含量較H2O2組明顯升高（P＜ 0.05），MDA含量較H2O2組明顯下降（P＜ 0.05）。見圖4。

2.3 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的BMSC凋亡的影響

圖4 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的BMSC中SOD、GSH、MDA的影響Fig.4 Effect of astaxanthin on SOD，GSH，and MDA levels in BMSCs subjected to H2O2-induced oxidative stress

為探究蝦青素預(yù)保護(hù)對H2O2誘導(dǎo)的BMSC凋亡是否有保護(hù)作用，使用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，H2O2組（59.6%）與對照組（2.7%）比較，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；蝦青素+H2O2組（17.3%）與H2O2組（59.6%）比較，細(xì)胞凋亡率明顯下降（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 蝦青素對H2O2誘導(dǎo)的BMSC凋亡的影響Fig.5 Effect of astaxanthin on apoptosis in BMSCs subjected to H2O2-induced oxidative stress

2.4 蝦青素通過Nrf2/ARE信號通路對H2O2誘導(dǎo)的BMSC發(fā)揮保護(hù)作用

采用Western blotting檢測Nrf2、HO-1、NQO1蛋 白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)均明顯降低（P＜ 0.05）；蝦青素+H2O2組Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)較H2O2組均明顯升高（P＜ 0.05）。說明蝦青素預(yù)保護(hù)能夠促進(jìn)Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)，其保護(hù)機(jī)制可能是激活了Nrf2/ARE信號通路。見圖6。

圖6 蝦青素通過激活Nrf2/ARE信號通路保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的BMSC氧化應(yīng)激損傷Fig.6 Astaxanthin protects BMSCs from H2O2-induced oxidative stress via the Nrf2/ARE signaling pathway

3 討論

BMSC具有較強(qiáng)的再生和分化能力，在組織修復(fù)和再生中具有重要作用［7］。然而，移植后細(xì)胞存在于氧化應(yīng)激微環(huán)境會(huì)導(dǎo)致其死亡，這一直是研究面臨的問題［8］。目前研究表明，輔酶Q可在體外保護(hù)BMSC氧化應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡，降低脊髓損傷大鼠的氧化應(yīng)激環(huán)境［9］；青蒿素通過激活c-Raf-Erk1/2-p90rsk-CREB通路對大鼠BMSC氧化應(yīng)激凋亡有保護(hù)作用［10］；石斛酚通過PI3K/Akt通路降低H2O2誘導(dǎo)的BMSC氧化損傷［11］。

蝦青素最主要的生物學(xué)作用是抗氧化作用，其通過獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，清除自由基和淬滅單線態(tài)氧［12］，在各組織器官中均發(fā)揮抗氧化作用［13］，具有極大的醫(yī)學(xué)潛力。氧化應(yīng)激是由于氧化劑MDA和抗氧化劑SOD-GSH之間不平衡導(dǎo)致［9］。本研究中，蝦青素預(yù)保護(hù)組較H2O2組SOD活性和GSH含量明顯提高，MDA含量下降，表明蝦青素具有抗氧化應(yīng)激的能力。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示，蝦青素預(yù)保護(hù)組較H2O2組細(xì)胞凋亡率明顯下降。

Nrf2/ARE信號通路被認(rèn)為是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的主要信號通路。Nrf2是一種在多種細(xì)胞中表達(dá)的堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子［14］，參與調(diào)節(jié)多種抗氧化酶表達(dá)。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2與keap1結(jié)合，呈無活性狀態(tài)；當(dāng)受到活性氧等刺激時(shí)，Nrf2與keap1脫離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核而激活，與ARE結(jié)合，激活HO-1、NQO1等抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而抵抗外界刺激［15］。本研究采用蝦青素預(yù)保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的BMSC，結(jié)果表明，蝦青素能夠提高細(xì)胞內(nèi)SOD活性和GSH含量、降低MDA含量、降低細(xì)胞凋亡水平、提高細(xì)胞存活率。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，蝦青素組的Nrf2通路被激活，Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)較H2O2組顯著升高。因此，蝦青素的保護(hù)機(jī)制可能通過激活Nrf2/ARE信號通路實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，蝦青素通過Nrf2/ARE信號通路對氧化應(yīng)激環(huán)境下的BMSC起抗凋亡和抗氧化作用?？捎糜诟杉?xì)胞移植療法中提高BMSC存活率，提高干細(xì)胞移植治療效率，為干細(xì)胞治療骨再生提供了新思路。