白志藝 李青

[摘要] 目的 通過生物信息學的方法對hTERT基因網(wǎng)絡及其相互作用的基因進行解密，研究hTERT共表達基因潛在的預后價值。方法 使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫鑒定黑素瘤中hTERT共表達基因，使用GSEA對激酶-靶標富集、miRNA-靶標富集和轉錄因子-靶標富集進行分析。DAVID在線數(shù)據(jù)庫對180個共表達基因進行GO和KEGG分析。STRING數(shù)據(jù)庫、Cytoscape軟件用于構建180個共表達基因的PPI網(wǎng)絡圖，并識別PPI網(wǎng)絡中最重要的模塊化基因。c-BioPortal分析模塊化核心基因的生存分析結果，Oncomine數(shù)據(jù)庫分析核心基因在黑素瘤組織和正常組織中的差異表達。 結果 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫挖掘結果提示hTERT與幾種腫瘤相關的激酶（如ATR）和轉錄因子（E2F家族）特異相關，這些激酶和轉錄因子調節(jié)基因組穩(wěn)定性、有絲分裂和細胞周期。hTERT表達與癌癥通路相關的功能網(wǎng)絡有關。篩選出共表達基因180個，網(wǎng)絡節(jié)度分析得到了8個核心基因，依次為TERT、ANLN、CDC25B、CDK4、CEP55、E2F7、KIF23、OIP5。蛋白-蛋白網(wǎng)絡互作圖（PPI）顯示，hTERT與CDK4在蛋白互作關系上是直接關聯(lián)。CDK4基因突變與擴增是黑素瘤患者DFS、OS的獨立預后因素（P=0.0163、6.843E-3）。結論 數(shù)據(jù)挖掘結果提示hTERT在黑素瘤中潛在的調控網(wǎng)絡信息，與hTERT共表達的CDK4基因可能是黑素瘤預后標志物，為進一步研究hTERT在黑素瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定了基礎。

[關鍵詞] 生物信息學;黑素瘤;hTERT;共表達基因

[中圖分類號] R735.7? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）35-0037-07

Analysis of hTERT co-expressed genes and gene regulatory network in melanoma based on bioinformatics

BAI Zhiyi1? ?LI Qing2

1.Department of Dermatology， First Affiliated Hospital of Xiamen University， Xiamen? ?361000， China; 2.Department of Dermatology， Longgang Maternal and Child Health Hospital， Shenzhen? ?518038， China

[Abstract] Objective To decrypt the hTERT gene network and its interacting genes through bioinformatics methods and study the potential prognostic value of hTERT co-expressed genes. Methods The LinkedOmics database was used to identify hTERT co-expressed genes in melanoma. GSEA was used to analyze kinase-target enrichment， miRNA-target enrichment， and transcription factor-target enrichment. The DAVID online database was used to conduct GO and KEGG analysis on 180 co-expressed genes. STRING database and Cytoscape software were used to construct a PPI network diagram of 180 co-expressed genes and identify the most important modular genes in the PPI network. The survival analysis results of modular core genes were analyzed using c-BioPortal. The Oncomine database was used to analyze the differential expression of core genes in melanoma tissues and normal tissues. Results The result of LinkedOmics database mining suggested that hTERT was specifically related to several tumor-related kinases （such as ATR） and transcription factors （E2F family）. These kinases and transcription factors regulated genome stability， mitosis， and cell cycle. The expression of hTERT was related to the functional network related to cancer pathways. A total of 180 co-expressed genes were screened， and 8 core genes were obtained by network node degree analysis， which were TERT， ANLN， CDC25B， CDK4， CEP55， E2F7， KIF23， and OIP5. The protein-protein network interaction map （PPI） showed that hTERT and CDK4 were directly related to the protein interaction relationship. CDK4 gene mutation and amplification were independent prognostic factors of DFS and OS in melanoma patients （P=0.0163， 6.843E-3）. Conclusion The data mining results suggest the potential regulatory network information of hTERT in melanoma. The CDK4 gene co-expressed with hTERT may be a prognostic marker of melanoma， which lay the foundation for further research on the role of hTERT in the occurrence and development of melanoma.

[Key words] Bioinformatics; Melanoma; hTERT; Co-expressed genes

85%～90%人類癌癥和70%以上永生人類細胞系的端粒酶活性高度升高[1]。目前有多個關于hTERT在黑素瘤中的預后研究[2-6]。研究證實，hTERT對黑素瘤發(fā)生發(fā)展過程起到重要作用，是黑素瘤的預后因素。然而，hTERT的生物學功能和意義尚未被充分闡明。不同的基因和通路參與了對hTERT的調控[7]。然而，hTERT與這些基因的相互作用機制并沒有被充分挖掘，為更好地理解端粒酶在黑素瘤中的功能，有必要對hTERT基因網(wǎng)絡及其相互作用的基因進行解密。研究hTERT共表達基因潛在的預后價值。因此，本研究使用數(shù)據(jù)挖掘技術，通過多個生物信息學數(shù)據(jù)庫來探討黑素瘤中hTERT共表達基因和功能網(wǎng)絡。進一步了解端粒酶的其他生物學功能。篩選hTERT共表達基因群中潛在預后標志物。

1 材料與方法

1.1 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析hTERT mRNA相關的差異表達基因

LinkedOmics數(shù)據(jù)庫[8]（http：//www.linkes.org/login.php）可用于分析32種收錄入TCGA數(shù)據(jù)庫中癌癥相關的多維數(shù)據(jù)集。使用LinkedOmics的LinkFinder模塊研究TCGA數(shù)據(jù)庫黑素瘤中hTERT共表達基因。使用GSEA對激酶-靶標富集、miRNA-靶標富集和轉錄因子-靶標富集進行了分析。檢驗標準P值<0.05，模擬500次。

1.2 預測分析MiR-497-5p靶基因

Hodi等[15]課題組前期工作中，發(fā)現(xiàn)hTERT是 miR-497-5p的直接靶向基因。miRNA與mRNA具有一對多及多對一的對應關系，同樣靶向miR-497-5p的基因群可能與hTERT富集于相同生物功能及信號通路。故本研究中倒轉過來，通過Targetscan，ENCORI數(shù)據(jù)庫來預測miR-497-5p的靶基因。尋找這組靶基因與hTERT共表達基因群之間的交集基因。

1.3 GO與KEGG通路分析

使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對180個取交集的基因組進行GO和KEGG分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4 PPI蛋白網(wǎng)絡構建與模塊分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫建立180個交集基因之間的功能蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡（PPI）。使用Cytoscape將這180個交集基因形成可視化網(wǎng)絡圖。通過MCODE識別PPI網(wǎng)絡中最重要的模塊。MCODE設置標準為：評分>5分，分度cut-off=2分，節(jié)點cut-off=0.2分，最大深度=100分，k-score=2分。

1.5 c-Bioportal數(shù)據(jù)庫進行生存分析

使用c-BioPortal分析模塊化核心基因的生存分析結果。

1.6 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析差異表達

使用Oncomine數(shù)據(jù)庫比較生存分析中有預后價值的核心基因在黑素瘤組織和正常組織中的差異表達，作為生存分析結果的第二佐證。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析黑素瘤中與hTERT mRNA相關的差異表達基因

使用LinkedOmics功能模塊分析TCGA數(shù)據(jù)庫中黑素瘤患者的hTERT共表達基因數(shù)據(jù)。火山圖（封三圖2）顯示，1402個基因（暗紅點）與hTERT mRNA呈顯著正相關，1518個基因（暗綠點）與hTERT mRNA呈顯著負相關（P<0.05）。50個重要的基因與hTERT mRNA呈正相關，50個與hTERT mRNA呈負相關。見封三圖3。這個結果表明hTERT基因對轉錄組有廣泛的影響。與hTERT mRNA相關性最高的前3個基因分別是TROAP、IQGAP3、SKA。與TROAP表達呈正相關（皮爾森相關系數(shù)=0.61，P=2.53E-07），IQGAP3（皮爾森相關系數(shù)=0.48，P=3.17E-07），和SKA3（皮爾森相關系數(shù)=0.47，P=5.75E-07）。

為進一步探討hTERT在黑素瘤中的靶點，分析GSEA產生的與hTERT正相關差異表達基因集的激酶、miRNA和轉錄因子靶點網(wǎng)絡。miRNA靶點只有一個MIR-19A，MIR-19B。激酶靶點網(wǎng)絡主要相關：polo樣激酶（PLK1），細胞周期檢測點激酶（CHEK2），細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK1），絲氨酸/蘇氨酸激酶（ATR），極光激酶B（AURKB）。轉錄因子-靶標網(wǎng)絡主要與E2F轉錄因子（E2F）家族相關，包括V[S] E2F4 DP1_01，V[S] E2F_02，V[S] E2F4DP2_01，V[S] E2F1DP2_01，V[S] E2F1DP1_01。見表1。

2.2 miR-497-5p靶基因

Targetscan，ENCORI數(shù)據(jù)庫預測miR-497-5p靶基因，取交集共鑒定出1515個靶基因。將miR-497-5p的靶基因與hTERT共表達基因群（2920個）取交集得到180個基因，見封三圖4。

2.3 交集基因的GO富集與KEGG通路富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫分析了180個交集基因的GO功能和KEGG通路富集分析。GO分析結果顯示，生物過程（BP）變化顯著富集于細胞周期、調控細胞增殖、細胞周期階段、細胞周期過程。細胞成分（CC）的變化主要集中在非細胞膜固定性細胞器、胞內細胞膜固定性細胞器、細胞骨架。分子功能（MF）的變化主要體現(xiàn)在核苷酸綁定，嘌呤核苷酸結合。KEGG 通路富集于癌癥中的通路、細胞周期。見表2。

2.4 PPI蛋白網(wǎng)絡構建與模塊分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫分析180個共表達基因的相互作用網(wǎng)絡，預測hTERT與這180個基因關系及hTERT潛在功能。通過 Cytoscape軟件將其可視化，利用 MCODE插件計算 PPI 網(wǎng)絡中每個基因的節(jié)點度（degree）（圖1），篩選 PPI 網(wǎng)絡中核心蛋白質的編碼基因（核心基因），共得到8個模塊化核心基因（圖2）。

2.5 核心基因在黑素瘤中的生存分析

利用c-Bioportal數(shù)據(jù)庫對核心基因進行總體生存分析（OS）及無病生存分析（DFS）。結果發(fā)現(xiàn)，有CDK4、E2F7改變的黑素瘤患者總體生存期（OS）較差，差異有統(tǒng)計學意義（P=6.843E-3、0.0128）。見圖3。黑素瘤患者伴有OIP5、CDK4 的改變顯示更差的無病生存（DFS）（P=0.038、0.0163）。見圖4。綜合分析，與hTERT表達密切相關的基因CDK4、E2F7、OIP5在黑素瘤的發(fā)生或進展中或許起到了重要作用，尤其是CDK4。因此，在下一步使用Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘CDK4在黑素瘤中的表達情況，作為其生存分析結果的佐證。

2.6 CDK4在黑素瘤組織中的差異表達

使用Oncomine數(shù)據(jù)庫來比較CDK4在黑素瘤組織和正常組織中的mRNA差異表達水平。發(fā)現(xiàn)CDK4在3個數(shù)據(jù)集中均表現(xiàn)為高表達，且表達差異有統(tǒng)計學意義（P=2.80E-5、0.009、0.003），其中1個數(shù)據(jù)表達為差異無統(tǒng)計學意義（P=0.568）。見圖5。合并4組數(shù)據(jù)進行meta分析。見封三圖5。結果顯示CDK4在黑素瘤中高表達，表達差異有統(tǒng)計學意義（P=0.004）。

3討論

黑素瘤是起源于表皮黑素細胞的高度惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚、黏膜[9]。發(fā)病率與死亡率逐年升高。發(fā)生發(fā)展機制尚不清楚。端粒存在于真核生物，是一種帽狀結構，位于線性染色體末端。端粒保護染色體末端不受降解、融合和重組的影響[10-11]。端粒是5-TTAGGG-3 DNA重復序列的長鏈，是由端粒酶（TERT）合成的，人類核心端粒酶由至少兩個基本亞基組成，即蛋白質亞基、人類端粒酶逆轉錄酶（hTERT）和RNA亞基、人類端粒酶RNA（hTR）[12]。hTERT位于5號染色體，由16個外顯子15個內含子組成，位于5號染色體的短臂上（5p.15：33），長度超過40 kb，與5p端之間有一個兆比特距離。hTERT啟動子區(qū)被認為是端粒酶表達非常重要的調控元件[10，13-14]。

黑素瘤是一種侵襲性腫瘤，具有不可預測的生物學行為。雖然各種治療方法已經用于治療黑素瘤，但存活率在過去幾十年里沒有顯著提高[15-16]。端粒酶逆轉錄酶（hTERT）是端粒酶全酶復合體的催化亞基，在細胞衰老和腫瘤發(fā)生中起重要作用。端粒酶調控的分子機制影響轉錄、轉錄后、翻譯后和亞細胞定位[14]。

hTERT誘導/端粒酶激活通過穩(wěn)定端粒長度使癌細胞具有無限的增殖潛能，而最近的觀察顯示，其多種致癌活性獨立于其對端粒功能增強作用，包括其對線粒體和泛素-蛋白酶體功能的影響，DNA損傷修復，基因轉錄、microRNA表達等。hTERT被發(fā)現(xiàn)直接與β-catenin及增強其轉錄調控效應，從而刺激上皮間充質轉化（EMT）[17-18]。近期有研究評估了mRNA轉錄的交替剪接作用。hTERT可以從多個不同的剪接轉錄本翻譯，只有最長的變體具有逆轉錄酶活性[19]。其他沒有催化功能的轉錄本在乳腺癌細胞系的過表達已被證明可以減少細胞凋亡，從而獲得生存優(yōu)勢[20]。這表明hTERT具有超越端粒延伸的新功能。因此本研究的生信分析可能為進一步探討hTERT激活端粒酶多樣的機制提供線索。

本次生信分析中，GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，主要涉及到細胞周期信號轉導，調控細胞周期，調控細胞的增殖、分裂。這與hTERT的功能是一致的。值得注意的是，本研究在分析核心基因的網(wǎng)絡互作時，發(fā)現(xiàn)hTERT與CDK4是直接相關的，而這兩個基因富集在癌癥通路中。

利用GSEA對靶基因進行富集分析，有助于揭示靶激酶、miRNA和轉錄因子的重要網(wǎng)絡。本研究結果表明，hTERT的功能網(wǎng)絡主要參與細胞周期。基因組不穩(wěn)定性和誘變是癌細胞的基本特征，激酶及其相關的信號通路有助于穩(wěn)定和修復基因組DNA[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)黑素瘤中的hTERT與包括ATR、AURKB和CDK1在內的激酶網(wǎng)絡相關。這些激酶調節(jié)基因組穩(wěn)定性、有絲分裂和細胞周期[23-24]。事實上，ATR是基因組穩(wěn)定性的核心激酶調節(jié)因子之一;它啟動細胞對基因組不穩(wěn)定和修復的反應，直接磷酸化1000多種重要的底物，包括腫瘤抑制基因p53蛋白和細胞周期調節(jié)蛋白[25]。ATR激酶抑制劑可殺傷腫瘤細胞，并與放化療的殺傷細胞協(xié)同作用[26]。在黑素瘤中，hTERT可能通過ATR激酶調節(jié)DNA復制、修復和細胞周期進展。

E2F2和E2F4是E2F家族中主要的轉錄因子，在增殖正常黑素細胞、黑素瘤細胞和新分離的黑素瘤中起作用。E2F1是細胞周期調控網(wǎng)絡的關鍵環(huán)節(jié)之一，可導致細胞凋亡、生長停滯或兩者同時發(fā)生[27]。E2F1異常表達參與了黑素瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究分析表明E2F1是hTERT的一個重要靶點，hTERT通過該因子調節(jié)黑素瘤的細胞周期和增殖能力。

8個核心基因的網(wǎng)絡互作圖中，hTERT與CDK4是直接相關的。CDKs是一種蛋白激酶，參與驅動細胞周期進展、控制轉錄過程和調節(jié)細胞增殖。在黑素瘤中，超過90%的病例中CDK4通路與激活基因組改變相關[28-29]。通過文獻回顧，發(fā)現(xiàn)CDK基因在黑素瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到了關鍵作用。本研究生信分析結果也驗證了這個觀點。Oncomine數(shù)據(jù)庫中挖掘結果發(fā)現(xiàn)其在黑素瘤組織與正常組織比較，表達差異有統(tǒng)計學意義，在c-Bioportal數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)挖掘結果顯示，CDK4基因突變與擴增是黑素瘤患者DFS、OS的獨立預后因素。此外，PPI網(wǎng)絡互作圖顯示，hTERT與CDK4在蛋白互作關系上是直接關聯(lián)的。

在機制上，對黑素細胞CDK4通路的系統(tǒng)研究表明，該通路的激活，加上端粒酶逆轉錄酶（hTERT）的引入，可以導致這些細胞的永生，但不足以轉化。缺乏p16INK4A/p14ARF等位基因失活突變的人黑素細胞衰老延遲，但可以通過引入hTERT而不朽[30]。此外，hTERT結合CDK4過表達或抑制RB1，使細胞不朽[31]。黑素細胞的獨特之處在于，除了hTERT的表達外，CDK4的激活是永生所必需的，而在大多數(shù)細胞系中單獨引入hTERT就足夠了。這闡明了hTERT與CDK4共表達對于黑素瘤細胞永生和抑制凋亡起到的獨有而關鍵的作用。

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘提示了hTERT在黑素瘤中潛在的調控網(wǎng)絡信息。并找到與hTERT共表達的CDK4基因可能是黑素瘤的潛在預后標記物。本研究使用基于最流行的生物信息學理論的在線工具，對公共數(shù)據(jù)庫中的腫瘤數(shù)據(jù)進行目標基因分析。與傳統(tǒng)的芯片篩選方法比較，該方法具有樣本量大、成本低、操作簡單等優(yōu)點。這使大規(guī)模的黑素瘤基因組學研究和隨后的功能研究成為可能。

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（收稿日期：2021-09-27）