鄭單單，魏文峰，霍金海，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

芪風(fēng)固表顆粒是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院自主研發(fā)的中藥新藥（發(fā)明專利號：CN1325098C，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字B20020410），該藥由黃芪、麥冬、防風(fēng)、刺五加、炒白術(shù)、五味子6 味中藥組成，具有益肺、健脾、補(bǔ)腎、益衛(wèi)固表、補(bǔ)氣生津的功效，是治療表虛不固易感病癥有效方劑。文獻(xiàn)報(bào)道表明，芪風(fēng)固表顆粒能止咳化痰，延長咳嗽潛伏期，又能緩解氣管炎癥，抑制肺組織病變，改善和治療支氣管炎和肺炎，減少肺部炎癥發(fā)作，能調(diào)節(jié)免疫功能，使機(jī)體免疫系統(tǒng)恢復(fù)到平衡狀態(tài)[1-4]。芪風(fēng)固表顆粒的藥理作用已有初步研究，然而其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全闡明。

中藥方劑成分復(fù)雜，口服給藥后，有效成分被直接吸收入血，或轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物被吸收入血。通過中藥血清藥物化學(xué)研究可以確立中藥中的有效成分，以此為指標(biāo)建立定性、定量方法，從而使中藥及中藥復(fù)方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化[5]。本研究利用中藥血清藥物化學(xué)方法初步研究芪風(fēng)固表顆粒的入血成分，旨在明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步鎖定建立芪風(fēng)固表顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化相關(guān)指標(biāo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITYTMUPLC 液相色譜儀（美國Waters 公司）；AB Sciex 5600+型質(zhì)譜儀、Analyst TF1.6 工作站（美國Sciex 公司）；PeakView 2.0 軟件、Metabolite pilot 2.0.2 軟件（美國Sciex 公司）；IKAMS3 digital 渦旋振蕩器（廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司）；ST16R 型低溫高速離心機(jī)（美國Thermofisher Scientific 公司）；MTN-2800W 氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥品

黃芪（批號20180909）、防風(fēng)（批號DC1111）、麩炒白術(shù)（批號180602）、麥冬（批號180501）、五味子（批號20180325）、刺五加（批號20171121）以上6 味飲片均購于北京同仁堂（亳州）飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院霍金海副研究員鑒定，黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao 的干燥根；防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia di varicate(Turcz.) Schischk.的干燥根；麩炒白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖蜜制麩皮炒制品；麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon j aponicus(L.f)Ker-GawL 的干燥塊根；五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實(shí)；刺五加為五加科植物刺五加Acanthopanax s enticosus(Rupr.et Maxim.) Harms 的干燥根和根莖或莖。

對照品升麻素苷（批號S-004-150421）、升麻素（批號 S-007-170426）、魯斯可皂苷元（批號L-009-171026）、芒柄花素（批號C-018-140128）均購于成都瑞芬思生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%。刺五加按《中國藥典》2015年版“刺五加水浸膏制備方法”制成刺五加浸膏。甲醇和乙腈（色譜級，Merck 公司）；甲酸（色譜級，F(xiàn)isher 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD 雄性大鼠，體質(zhì)量（240±20）g，SPF級，許可證號SCXK（黑）2019-001，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。該實(shí)驗(yàn)由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：201903001。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 芪風(fēng)固表顆粒供試品的制備

按照2020 版《中國藥典》[6]規(guī)定，取黃芪3000 g、白術(shù)（炒）1000 g、五味子500 g，防風(fēng)1000 g、麥冬1000 g，加水煎煮2 次，煮沸起開始計(jì)時(shí)，每次1 h，合并煎液，離心，濾過，靜置24 h，傾取上清液，加入刺五加浸膏75 g，濃縮至相對密度1.20～1.22（60 ℃）的清膏，趁熱加入糊精適量，混勻，60 ℃干燥，粉碎成細(xì)粉，加乙醇適量制粒，干燥。按《標(biāo)準(zhǔn)》的1/20 用藥量以上述方法，制備芪風(fēng)固表顆粒供試品。

2.2 供試品溶液的制備

取供試品芪風(fēng)固表顆粒粉末約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇水30 mL，密塞，稱定重量，超聲處理50 min，放冷至室溫，用50%甲醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量后搖勻，5000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.3 藥液的制備

取芪風(fēng)固表顆粒供試品，加適量蒸餾水超聲溶解，配制成質(zhì)量濃度1.08 g/mL 的芪風(fēng)固表顆粒大鼠ig 藥液，儲(chǔ)存至4 ℃冰箱中，備用。

2.4 體內(nèi)分析樣品的制備

取SD 大鼠，禁食12 h（自由飲水），給藥組按照9.0 g/kg（相當(dāng)于人體臨床每日10 倍劑量）ig 給予芪風(fēng)固表顆粒ig 藥液，空白組按照20.0 mL/kg ig給予蒸餾水。給藥1 h 后，ip 10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3000 r/min 離心10 min，取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取大鼠空白血清及給藥血清各1.2 mL，各加4.8 mL 甲醇，3000 r/min 渦旋震蕩90 s，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min，取上清液，氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?50 μL 70%甲醇復(fù)溶，3000 r/min 渦旋震蕩90 s，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min，取上清液，進(jìn)樣3 μL 供UPLC-Q-TOF-MS 分析。

2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧正、負(fù)離子模式，正、負(fù)離子源電壓分別為5500 V、-4500 V，離子源溫度為550 ℃，霧化氣體為N2，霧化氣、輔助氣壓力均為379.2 kPa，氣簾氣壓力為241.3 kPa，裂解電壓為±80 V，碰撞能量為±35 eV，碰撞能量擴(kuò)展均為15 eV。TOF/MS 掃描范圍為m/z100～1500，IDA 設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個(gè)最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，Product Ion 掃描范圍為m/z50～1500，開啟動(dòng)態(tài)背景扣除（DBS）。數(shù)據(jù)采集所用軟件為Analyst TF 1.6 software，數(shù)據(jù)處理軟件為Peakview 2.0-masterview 1.0。

2.6 色譜條件

Waters ACQUITYTMUPLC 液相色譜儀；ACQUITYTMBEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；ACQUITYTMUPLC BEH C18預(yù)柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脫：0→15 min，95%→50% A；15→18 min，50%→0 A；18→18.1 min，0→95% A；18.1→20 min，95% A。體積流量0.3 mL/min；樣品倉溫度4 ℃；進(jìn)樣量8 μL；色譜儀流出液不分流直接進(jìn)行正、負(fù)離子掃描檢測。

2.7 數(shù)據(jù)分析方法

利用Peakview 軟件通過對比給藥后血清和空白血清的質(zhì)譜圖，扣除血清中的內(nèi)源性成分，將剩余離子峰與體外藥材提取液離子峰的保留時(shí)間、質(zhì)荷比及二級質(zhì)譜圖進(jìn)行對比，如果一致則確認(rèn)為芪風(fēng)固表顆粒中的原型成分；利用MetabolitePilot 數(shù)據(jù)處理軟件，導(dǎo)入化合物信息建立 Compound library，設(shè)置Biotransformation parameters，選擇I和II 相代謝途徑，設(shè)置Processing parameter，將空白血清及給藥血清樣品導(dǎo)入，篩選代謝產(chǎn)物，根據(jù)軟件數(shù)據(jù)結(jié)果和參考文獻(xiàn)資料推測其代謝產(chǎn)物。

圖1 正離子和負(fù)離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion current chormatograms in positive and negative ion mode

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS 色譜圖的采集

依據(jù)“2.5”項(xiàng)質(zhì)譜條件及“2.6”項(xiàng)色譜條件分析樣本，在正、負(fù)離子模式下采集以上樣品的色譜圖，見圖1。

3.2 入血成分分析

本課題組前期已經(jīng)應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對芪風(fēng)固表顆粒的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，在分析過程中根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、同位素豐度比、分子碎片峰，參考相關(guān)文獻(xiàn)、對照品色譜保留時(shí)間及二級譜圖，共推斷了110 個(gè)化合物，其中22 個(gè)來自黃芪，13 個(gè)來自防風(fēng)，6 個(gè)來自白術(shù)，10 個(gè)來自麥冬，21 個(gè)來自五味子，14 個(gè)來自刺五加。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上根據(jù)“2.7”項(xiàng)下方法，結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道[7-11]，并參照對照品二級色譜圖，鑒定了大鼠口服芪風(fēng)固表顆粒后血清中的37 個(gè)入血成分，其中17 個(gè)為原型成分，20 個(gè)為代謝產(chǎn)物，并對其來源進(jìn)行了歸屬，結(jié)果見表1。

3.3 主要色譜峰的質(zhì)譜分析

3.3.1 原型成分 共鑒定和表征出17 個(gè)原型成分，分別以化合物3、9 為例說明推測過程。

化合物3：正離子模式下，其在含藥血清總離子圖與芪風(fēng)固表顆粒總離子流圖中升麻素的保留時(shí)間基本一致，二級質(zhì)譜碎片一致，準(zhǔn)分子離子峰m/z307 [M＋H]＋相對豐度最強(qiáng)，擁有共同二級碎片m/z289、259、235 等，見圖2，參考文獻(xiàn)報(bào)道[7]，對比升麻素對照品的二級質(zhì)譜圖，故推測其結(jié)構(gòu)為升麻素，可能的裂解途徑見圖3。

化合物9：正離子模式下，其與芪風(fēng)固表顆?？傠x子流圖中魯斯可皂苷元的保留時(shí)間基本一致，二級質(zhì)譜碎片一致，準(zhǔn)分子離子峰m/z431 [M＋H]+相對豐度較強(qiáng)，擁有共同二級碎片m/z395、269 等，見圖4，參考文獻(xiàn)報(bào)道[8]，對比魯斯可皂苷元對照品的二級質(zhì)譜圖，故推測其結(jié)構(gòu)為魯斯可皂苷元，可能的裂解途徑見圖5。

表1 芪風(fēng)固表顆粒入血成分分析結(jié)果Table 1 Chemical composition analysis results of Qifeng Gubiao Granules

續(xù)表1

續(xù)表1

圖2 升麻素正離子模式下的MS/MS 質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS mass spectrum of atractylodin in a positive mode

3.3.2 代謝產(chǎn)物 根據(jù)“2.7”項(xiàng)下方法結(jié)合Metabolite Pilot 代謝物數(shù)據(jù)處理軟件給出的代謝物最優(yōu)化峰匹配，最終推測20 個(gè)代謝產(chǎn)物，以化合物27、36 為例說明鑒定過程。

圖3 推測的升麻素裂解途徑Fig.3 Speculative cleavage pathway of atractylodin

圖4 魯斯可皂苷元正離子模式下的MS/MS 質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS mass spectrum of ruscogen in positive mode

圖5 推測的魯斯可皂苷元裂解途徑Fig.5 Speculative cleavage pathway of ruscogen

化合物27：刺五加中的刺五加苷類成分是其主要活性部位，紫丁香苷是主要成分之一。紫丁香苷是苯丙醇的苷類化合物，該化合物在體內(nèi)發(fā)生I 相水解反應(yīng)，失去脫氧葡萄糖水解為苷元，其苷元脫氧后苯環(huán)上的羥基發(fā)生硫酸酯化，形成硫酸酯化代謝產(chǎn)物。代謝物在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰m/z273 [M－H]-，比紫丁香苷準(zhǔn)分子離子峰m/z371 [MH]-少98，提示其失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化，結(jié)合碎片m/z191、153 等，與紫丁香苷二級碎片比較，符合其裂解過程，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[9]，紫丁香苷苷元苯環(huán)上的羥基可能發(fā)生硫酸酯化。紫丁香苷失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化產(chǎn)物和紫丁香苷在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜匹配度見圖6，可能的裂解途徑見圖7。

化合物36：芒柄花素是來自黃芪的黃酮類化合物，易發(fā)生II 相代謝反應(yīng)，A 環(huán)7 位羥基發(fā)生葡萄糖醛酸化，生成芒柄花素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。該產(chǎn)物在負(fù)離子模式下，準(zhǔn)分子離子峰m/z443 [MH]-，比異微凸劍葉莎醇準(zhǔn)分子離子峰m/z301 [MH]-多142，表明化合物發(fā)生葡萄糖醛酸化，結(jié)合其特征碎片m/z267、251、223 等，與芒柄花素二級碎片比較，符合其葡萄糖醛酸化過程，參考文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]，芒柄花素A 環(huán)7 位羥基易發(fā)生葡萄糖醛酸化，同時(shí)芒柄花苷在大鼠體內(nèi)發(fā)生I 相代謝水解后，生成芒柄花素，亦可能有相同代謝產(chǎn)物。芒柄花素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物和芒柄花素在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜匹配度見圖8，推測的裂解途徑見圖9。

圖6 紫丁香苷失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化產(chǎn)物和紫丁香苷負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.6 Mass spectra of sulphate conjugation after lost deoxyglucose and oxygen of syringin in negative mode

圖7 推測的紫丁香苷失去脫氧葡萄糖脫氧后硫酸酯化產(chǎn)物裂解途徑Fig.7 Speculative cleavage pathway of sulphate conjugation after lost deoxyglucose and oxygen of syringin

圖8 芒柄花素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物和芒柄花素在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜圖Fig.8 Mass spectra of glucuronidation of formononetin in negative mode

圖9 推測的芒柄花素葡萄糖醛酸化產(chǎn)物裂解途徑Fig.9 Speculative cleavage pathway of glucuronidation of formononetin

4 討論

本實(shí)驗(yàn)在取血方式上，選取腹主動(dòng)脈取血，腹主動(dòng)脈取血的取血量較大，更適合用于后續(xù)的樣品制備。在樣品處理方法上，比較了甲醇沉淀法、固定相萃取-甲醇洗脫法2 種血清處理方法，結(jié)果顯示，甲醇沉淀法檢測到的血中移行成分較多，故選擇甲醇沉淀法作為血清最佳處理方法。在釆血時(shí)間上考察了0、0.5、1、2、4、8、12、24 h 共8 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果在給藥1 h 后采血所檢測的色譜峰數(shù)目最多、響應(yīng)值最強(qiáng)，故選擇給藥1 h 后采血為最佳采血時(shí)間點(diǎn)。

在大鼠ig 芪風(fēng)固表顆粒ig 藥液后的含藥血清中共鑒定出37 個(gè)入血成分，包括17 個(gè)原型成分，20 個(gè)代謝產(chǎn)物。其中來自黃芪的多為黃酮類成分，黃芪中的芒柄花素及其苷類、毛蕊異黃酮及其苷類等黃酮類成分，能抗病毒[12]，改善肺纖維化肺功能[13]，還能通過降低模型動(dòng)物的脾細(xì)胞輔助T 細(xì)胞1/輔助T 細(xì)胞2（T helper 1 cell/T helper 2 cell，Th1/Th2)和高細(xì)胞增殖活性等改善其機(jī)體免疫功能失調(diào)，又能增強(qiáng)機(jī)體的耐力[14]。防風(fēng)的主要成分升麻素等色原酮及其苷類，具有解熱抗炎[15]作用。刺五加中的紫丁香苷等刺五加苷類[16]及有機(jī)酸類等成分，可能具有抗疲勞[17]，調(diào)節(jié)免疫功能等多重作用。五味子具有免疫調(diào)節(jié)作用[18]。麥冬中的主要皂苷元魯斯可皂苷元具有抗炎作用，馬麗等[19]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，魯斯可皂苷元可顯著抑制細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導(dǎo)的急髓白血病HL-60 細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮ECV304 細(xì)胞之間的黏附作用，從而發(fā)揮抗炎活性。結(jié)合各味藥傳統(tǒng)功效及現(xiàn)代藥理學(xué)研究，初步可以推斷，本次實(shí)驗(yàn)分析所得入血的37 種成分可能為其體內(nèi)發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用中藥血清藥物化學(xué)方法及UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，簡單、快捷分析了中藥復(fù)方芪風(fēng)固表顆粒中的入血成分，初步探究了該方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)一步鎖定其質(zhì)量控制指標(biāo)性成分，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升研究提供依據(jù)，為傳統(tǒng)品種的二次開發(fā)提供了良好的參考依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突