＊鄧春萍 肖鵬 崔學(xué)嚴(yán) 萬(wàn)利瓊 鄭舒麗 王林娟

（西南石油大學(xué) 四川 610500）

引言

由于過(guò)去數(shù)年間各大油田區(qū)采油工藝的相對(duì)落后和密閉性不佳，加之環(huán)境保護(hù)措施、意識(shí)和影響評(píng)價(jià)體系相對(duì)落后、污染控制和相應(yīng)修復(fù)技術(shù)的缺乏，我國(guó)油田區(qū)土壤的石油污染程度遠(yuǎn)高于其他發(fā)達(dá)國(guó)家，土壤的石油污染呈逐年累積加重態(tài)勢(shì)。目前，石油污染土壤嚴(yán)重影響了我國(guó)油田區(qū)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境，成為當(dāng)?shù)厣鐣?huì)、經(jīng)濟(jì)和環(huán)境可持續(xù)發(fā)展最主要的制約因素。因此，石油污染土壤的修復(fù)，已經(jīng)成為我國(guó)當(dāng)前環(huán)境領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)和亟待解決的重大環(huán)境問(wèn)題之一[1]。

微生物法修復(fù)石油污染土壤，是指通過(guò)改變微生物外部生活環(huán)境和依照生物自身的遺傳變異規(guī)律來(lái)提高石油降解速度和程度的一種修復(fù)方法[2]。石油烴污染物疏水性強(qiáng)，溶解度低，土壤中有機(jī)物質(zhì)對(duì)石油烴有吸附作用，這些因素大大降低了土壤中石油的微生物可利用度，影響微生物修復(fù)效率[3]。采用表面活性劑提高污染物的溶解度是提高其生物可利用度的有效途徑，微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中所分泌的生物表面活性劑因其具有較高的界面活化能力以及對(duì)環(huán)境無(wú)二次污染等特性，在提高污染物的生物可利用度方面得到越來(lái)越多的重視[4]。

2020年Xin Hu等人發(fā)現(xiàn)紅球菌HX-2是生物表面活性劑的有效生產(chǎn)者，該表面活性劑表現(xiàn)出所需的生物修復(fù)特性。生物表面活性劑NK由于其在各種熱、酸、堿和高鹽條件下的穩(wěn)定性而成為一種有吸引力的環(huán)境修復(fù)工具。與其他幾種表面活性劑相比，它對(duì)石油和多環(huán)芳烴的溶解速度也很高，最重要的是它增強(qiáng)了微生物降解石油的能力[5]。2019年楊忠平等人提出表面活性劑強(qiáng)化修復(fù)技術(shù)（SER）可使地下環(huán)境中的污染物解吸和淋出，對(duì)去除砂土層殘留態(tài)非水相液體（Nonaqueous Phase Liquids，NAPLs）具有顯著效果，適合石油類污染的修復(fù)工作，但其解吸效率受土壤顆粒性質(zhì)、孔隙度與滲透率等因素的限制，助驅(qū)能力存在極限，不能完全將土壤中的石油污染物洗脫[6]。2007年譚麗泉等人提出降解菌對(duì)表面活性劑的優(yōu)先利用消耗了必要的養(yǎng)分,同時(shí)削弱了其增溶作用,因此抑制了多環(huán)芳烴（PAHs）的降解[7]。

總體來(lái)看，盡管當(dāng)前對(duì)使用表面活性劑刺激石油土壤污染的生物修復(fù)有一定研究，但研究結(jié)果顯示影響效果不確定，添加表面活性劑可能提高微生物修復(fù)效果，也可能對(duì)微生物具有一定的毒性，限制微生物修復(fù)。但關(guān)于表面活性劑對(duì)石油污染土壤生物修復(fù)效果的影響因素、內(nèi)在機(jī)制的系統(tǒng)研究還不足[8]。為此，本文選用鼠李糖脂生物表面活性劑、β-環(huán)糊精、聚氧乙烯醚（Tween-80）、十二烷基硫酸鈉（SDS）作為研究對(duì)象，研究表面活性劑對(duì)石油污染土壤生物修復(fù)的影響，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)表面活性劑，并優(yōu)化投放濃度，為表面活性劑強(qiáng)化生物修復(fù)石油污染土壤應(yīng)用提供相關(guān)參考意見(jiàn)。

圖1 含油率變化

1.材料與方法

(1)實(shí)驗(yàn)材料

供試土壤：清潔土壤（砂土）采自西南石油大學(xué)附近地區(qū)。

污染物：石油烴，取自中國(guó)石油化工有限公司。

石油降解菌：試驗(yàn)添加的石油降解菌為經(jīng)富集和馴化的混合降解菌。

Tween-80：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

十二烷基硫酸鈉（SDS）：純度，AR，上海凜恩科技發(fā)展有限公司。

鼠李糖脂：純度，≥95%，上海麥克林生化科技有限公司。

β-環(huán)糊精：純度，≥95%，上海凜恩科技發(fā)展有限公司。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

①土壤制備

前期的土壤準(zhǔn)備，土壤選自本校的無(wú)污染土壤。收集好土壤之后，將土壤運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行2周的晾曬，土壤去除根莖、樹(shù)葉、碎石子等后經(jīng)室內(nèi)風(fēng)干、破碎、研磨，過(guò)20目篩。通過(guò)篩子過(guò)篩得到干燥的較小顆粒土壤，后通過(guò)加入不同量的用石油醚溶解過(guò)的石油模擬不同濃度石油污染的土壤。首先，分別配制了石油質(zhì)量占比為3%、5%、7%、9%的4個(gè)濃度梯度的石油污染土壤。

②無(wú)機(jī)培養(yǎng)基制備

取超純水1L，NaNO31.5g，KCl 0.5g，(NH4)2SO41.5g，MgSO40.5g，K2HPO41g，CaCl20.002g，F(xiàn)eSO40.01g于錐形瓶中，調(diào)節(jié)溶液pH在7.0-7.2范圍內(nèi)，于121℃下滅菌20min。

③接種菌群

混合降解菌接種自油泥，并在模擬污染物（石油）為碳源的無(wú)機(jī)培養(yǎng)中富集和馴化培養(yǎng)。經(jīng)菌種鑒定，混合降解菌主要包含寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、假單胞菌屬Pseudomonas和芽胞桿菌屬Bacillus。在無(wú)菌條件下向錐形瓶中加入配制好的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基、1g原油并加入1%菌液，先用稱量紙緊緊包住錐形瓶，后用報(bào)紙緊緊包住，放到搖床中，轉(zhuǎn)速為140r/min，培養(yǎng)10天標(biāo)記為母液。以母液為菌液重復(fù)以上步驟再制備5組。以100g為一份，將四種污染程度的土壤各分17份，裝入相同的容器中。其中一份不加菌液也不加表面活性劑，只加入等量純水為空白參照。而后將四種表面活性劑依次配制4組不同濃度的溶液。將配置好的16組溶液等量依次加入到每種污染程度的等量小份土壤中，半小時(shí)后接著向土壤中加入等量的菌液。為保證土壤中的菌液正常生長(zhǎng)，每天加入適量的純水。

④含油率測(cè)定

從每一種污染程度的土壤中取5g，測(cè)定并記錄初始含油率，即第0天的含油率。之后每間隔5天，測(cè)定一次含油率，共測(cè)量記錄4次。對(duì)比分析數(shù)據(jù)，分析降解菌對(duì)石油降解的作用情況、同樣污染程度下不同表面活性劑的作用情況、不同污染程度下同一表面活性劑的作用情況、各種表面活性劑對(duì)于菌落降解石油的影響等。

2.結(jié)果與討論

(1)原始污染土壤粒徑占比

由表1原始污染土壤粒徑占比可得，原始污染土壤中粒徑在0.15mm-0.9mm的土壤占比64.6%，少部分土壤粒徑在0.15mm以下，極少部分土壤粒徑大于0.9mm。綜合分析可得，實(shí)驗(yàn)使用土壤主要為沙土，土壤間隙較大，適合于好氧微生物生長(zhǎng)以及土壤中石油烴的降解。

表1 原始污染土壤粒徑占比（%）

(2)供試土壤指標(biāo)

表2 供試土壤指標(biāo)

根據(jù)土壤營(yíng)養(yǎng)分級(jí)，土壤pH屬于低堿性，有機(jī)質(zhì)含量等級(jí)為中上，總氮含量等級(jí)為中等，堿解氮含量等級(jí)中上，總磷含量等級(jí)高，速效磷含量等級(jí)高，速效鉀含量等級(jí)中上偏高，總體土壤營(yíng)養(yǎng)環(huán)境較好，適合微生物的生長(zhǎng)。

(3)含油率變化圖

根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做出的圖，分析可得表面活性劑的加入可以提高石油降解率。

根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做出的圖，對(duì)原含油量為3%的數(shù)據(jù)組進(jìn)分析：從第7天到第21天時(shí)，空白對(duì)照組（未接種也未加表面活性劑）含油量基本沒(méi)有變化，加了1.7% SDS組含油量下降了59%，其次是5.1% SDS下降了41.9%。而0%和9.6% β-環(huán)糊精、0.45%和0.9%的tween80、0% SDS均只下降了24%左右。剩余的3.4% SDS、3.2% β-環(huán)糊精、1.35% tween80均只下降了16%左右。綜上，得1.7%SDS效果最好。

根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做出的圖，對(duì)原含油量為5%的數(shù)據(jù)組進(jìn)分析：在7至21天土壤中的含油率均在下降，其中與0.76%鼠李糖脂效果最好，而0.38%鼠李糖脂次之。經(jīng)過(guò)28天的實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)鼠李糖脂效果最好，其中0.76%的鼠李糖脂對(duì)石油降解的效率最好,下降了約51.5%,而0%鼠李糖脂下降了48.1%，0.38%鼠李糖脂含油率下降了45.54%.由于實(shí)驗(yàn)操作中數(shù)據(jù)測(cè)量可能存在誤差，導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)并不準(zhǔn)確，存在一定誤差?？偟膩?lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)28天的觀測(cè)，0.76%鼠李糖脂對(duì)石油含量5%的土壤降解效果最好。

根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做出的圖，對(duì)原含油量為7%的數(shù)據(jù)組進(jìn)分析：從圖線總體趨勢(shì)來(lái)看，空白對(duì)照組和0%的SDS組中含油率幾乎沒(méi)有變化；1.7%的SDS組含油率下降了5.36%、3.4%的SDS組下降了7.11%，此效果不如單一使用微生物時(shí)的效果，所以該種表面活性劑不建議使用，可能會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)；6.4%的β-環(huán)糊精組下降了2.3%，可能是表面活性劑濃度過(guò)高抑制了微生物的生長(zhǎng)、0.90%的tween80組下降了9.56%；0.38%的鼠李糖脂組和0.76%的鼠李糖脂組含油率下降幅度大，分別下降了40.4%和43.76%，大于不加表面活性劑對(duì)照，說(shuō)明鼠李糖脂的加入促進(jìn)了石油烴在土壤中的微生物修復(fù)。從各組最后的含油量與初始含油量的比較中可以得出，降低含油量效果最好的是，0.76%的鼠李糖脂，其次是0.38%的鼠李糖脂。不同的表面活性劑降低含油率效果不同，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，鼠李糖脂的效果＞tween80＞SDS＞β-環(huán)糊精。

根據(jù)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)做出的圖，對(duì)原含油量為9%的數(shù)據(jù)組進(jìn)分析：由圖中曲線趨勢(shì)可見(jiàn)，無(wú)論哪種表面活性都可使體系含油率下降，對(duì)比發(fā)現(xiàn)其中β-環(huán)糊精效果最好，SDS次之，最后是tween80，數(shù)據(jù)表明，濃度對(duì)表面活性劑有影響但并非單純的線性關(guān)系，3.2%β環(huán)糊精效果最好，土壤含油率下降百分?jǐn)?shù)為64%，其次是0.90%tween80，土壤含油率下降百分?jǐn)?shù)為51%，其余土壤含油率下降百分?jǐn)?shù)為40%左右，綜上所述3.2%β-環(huán)糊精效果最好，其次是0.90%的tween80。

綜上所述，0.38%的鼠李糖脂對(duì)石油含量7%的土壤降解效果最好，性價(jià)比最高，達(dá)到了40.4%，明顯高于[9]中的19.5%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)的菌株與表面活性劑的濃度配比合適，對(duì)微生物修復(fù)的增強(qiáng)效果十分的明顯。1.7%SDS組含油量下降了59%，明顯高于[10]中的46%,S說(shuō)明低濃度的SDS對(duì)土壤石油烴的微生物降解具有明顯增強(qiáng)效果；3.2% β-環(huán)糊精對(duì)石油含量9%的土壤降解效果最好達(dá)到64%，明顯高于[11]中的降解率45%。從四種表面活性劑下對(duì)比下可知，鼠李糖脂和β-環(huán)糊精作為一種可以增強(qiáng)微生物降解石油烴的表面活性劑，總體效果較好，并且明顯的提高降解效果，值得思考的是，在以往研究中還有考慮土壤含水率的問(wèn)題[12]，含水率對(duì)表面活性劑的增強(qiáng)效果也有巨大影響[12]，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以探究含水率和菌種濃度對(duì)修復(fù)效果的影響。