彭喜之，王濤輝 ， 馬珺 怡，童應凱，王雪梅，張 敏，葉玉棟，陳帥君*

(1. 天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院生物技術(shù)系 天津300384；2. 天津恒基利得生物科技發(fā)展有限公司 天津300392)

0 引 言

土壤是農(nóng)業(yè)發(fā)展基本的生產(chǎn)資料，土壤質(zhì)量優(yōu)略直接影響農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展。鹽堿化是影響土壤質(zhì)量的一個關(guān)鍵問題。鹽堿地是鹽類集積的一個種類，是指土壤里面所含大量的鹽分會破壞土壤水分的平衡，改變土壤的結(jié)構(gòu)，致使土壤通透性變?nèi)酰瑵B透率變大，容易板結(jié)和膠粘，土壤肥力下降，影響到作物的正常生長。我國有 9913萬公頃鹽堿化土地[1]，堿土和堿化土壤的形成，大部分與土壤中碳酸鹽的累積有關(guān)，因而堿化度普遍較高，嚴重的鹽堿土壤地區(qū)植物幾乎不能生存[2]。

本研究通過微生物發(fā)酵菌肥修復技術(shù)來對鹽堿土和酸性土進行改良[3]。鹽堿土中富含大量鹽堿成分，而酸性土壤中存在著過酸物質(zhì)，故制備微生物菌肥所用的微生物菌株必需具有耐酸、耐鹽、降鹽特性，才能在鹽堿化和酸化土壤中起到治理作用[4]。研究選育耐鹽、降鹽微生物在本課題中具有關(guān)鍵作用，如果能從過酸、過堿物質(zhì)或土壤中提取出某些具有抗酸堿性并能在其環(huán)境下生長的菌種[5]，將其投入肥料生產(chǎn)，施肥于鹽堿土地，可以達到改良土地酸堿性的目的。本文從動物糞便與鹽堿土壤中提取出部分菌種，用于進行鹽梯度生長測試；篩選出 4個耐鹽菌株，通過分別測試其對鹽堿土和酸性土的中和降解能力，研究4種菌與肥料混合發(fā)酵后對土壤酸堿性調(diào)節(jié)的最佳比例并獲得了成功。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與菌種

從天津靜海雞養(yǎng)殖場(恒基利得生物科技發(fā)展有限公司)獲取的雞糞便、鹽堿土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂 15～20g，水 1000mL，pH 7.0～7.2。

M6 培養(yǎng)基：MgS04·7H20 0.25g，葡萄糖 10g，NaCl 20g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO42.0g，KH2PO413.6g，去離子水 1000mL，pH 7.5(KOH 調(diào)節(jié))。用于菌株篩選培養(yǎng)。

M63 鹽梯度培養(yǎng)基：FeSO4·7H20 0.5g；KH2PO413.6g；(NH4)2SO42.0g；MgSO4·7H2O 0.25g；葡萄糖10g；NaCl視需要，自來水1000mL，pH 7.5(KOH調(diào)節(jié))。用于菌株篩選培養(yǎng)。

1.2 主要儀器

pH儀(STARTER 2100S上海奧豪斯儀器公司)，無菌操作臺(BCM-1300A 蘇凈安泰)，恒溫培養(yǎng)箱(PH240A 上海一恒科技有限公司)，電子天平(AR124CN 上海奧豪斯儀器公司)，高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-30FBS 上海申安醫(yī)療器械廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 微生物菌株分離

根據(jù)吳曉衛(wèi)[4]的方法，從雞糞和鹽堿土壤中分離菌種。

1.3.2 耐鹽菌篩選

選取培養(yǎng)皿上生長快、直徑大的菌株用平板劃線法接在平板上，在 30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72h。所得菌落再次劃線轉(zhuǎn)接到平板上并在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，之后將平板上的單菌落轉(zhuǎn)接斜面，置于冰箱 4 ℃保存。其中每項操作均重復3次。

篩選出 4 種生長良好的菌：N1、N2、N3、N4。篩選結(jié)果生長情況見表1。

1.3.3 菌株形態(tài)鑒定

將所得菌株劃線轉(zhuǎn)接到富集培養(yǎng)基平皿內(nèi)，30℃恒溫培育 24h后，顯微鏡觀看菌株生長情況和形態(tài)特征：記錄菌體形態(tài)、菌體大小、菌落質(zhì)地、菌落邊緣。鑒定參照微生物學《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》實行。

表1 菌落篩選結(jié)果Tab.1 Results of colony screening

1.3.4 所選菌株性能檢測

將經(jīng)過鑒定的微生物菌株分別接入液體鹽梯度培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含 NaCl量分別為 10、20、30、40、50、60g/L。30℃恒溫搖瓶發(fā)酵 24h，運用紫外分光光度計法吸光度 595nm值[9]檢測發(fā)酵液內(nèi)菌體數(shù)來判定菌株對鹽耐受生長情況[9]。

1.4 微生物菌肥發(fā)酵工藝

1.4.1 發(fā)酵原料和工藝流程

以雞糞為原料，糞便含水量很高，pH自然。

圖1 工藝流程Fig.1 Process flo w

斜面保藏的菌種轉(zhuǎn)接到相應的培養(yǎng)基培養(yǎng)進行活化，30 ℃恒溫 24h。巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和假單胞菌用肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)[10]；酵母用 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]?；罨蟮木炅舸龜U大培養(yǎng)。

1.4.2 混合菌劑拮抗性能研究

將所得到的固體菌劑按照不同比例混合制備混合菌劑[12]，并轉(zhuǎn)接到同一肉胨平板上和同一肉胨培養(yǎng)基搖瓶內(nèi)培養(yǎng)，探究混合菌劑間是否產(chǎn)生拮抗抑制作用[13]。通過觀察平板上菌落生長情況、菌落數(shù)目、表面形態(tài)和檢測搖瓶內(nèi)各菌含量判斷是否具有拮抗作用。

1.4.3 復配方案

按照吳曉衛(wèi)[4]的方法，按照 1%接種量將混合菌劑接入糞便混合物中進行發(fā)酵，研究不同比例制成的混合菌劑對發(fā)酵結(jié)果的影響[14]。以發(fā)酵菌肥中大分子有機質(zhì)降解多(有機質(zhì)含量高)、活菌數(shù)目多和發(fā)酵過程升溫快、保溫時間長(有利于殺死糞便中的蟲卵、病毒或減少有害物質(zhì)和促進菌肥腐熟)的混合比例作為菌種最佳復配比例，最佳比例見表2。

1.5 土壤pH值恢復測定

1.5.1 單菌種對土壤pH值恢復測定

取天津農(nóng)學院內(nèi)農(nóng)學種植土壤用 NaOH和 HCl調(diào)節(jié) pH＝2、4、6、8、10、12、14，每個分組做 3 次，取平均值[14]。將各試驗菌種分別施入并測定其對pH的恢復能力，設立一組對照組，加入等量超純水進行對照[15]。

表2 混合比例Tab.2 Mixing ratio

1.5.2 復配菌種對培養(yǎng)基pH恢復能力測定

按復配方案中的比例將其與肥料混合發(fā)酵，再次取天津農(nóng)學院內(nèi)農(nóng)學種植土壤用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH＝2、4、6、8、10、12、14，每個分組做 3 次，取平均值[16]。施入并測定4種方案對pH值的恢復能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)鑒定

根據(jù)微生物學《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》判斷出圖 2至圖 5的結(jié)果。N1為巨大芽孢桿菌屬，N2為枯草芽孢桿菌屬，N3為假單胞菌屬，N4為酵母菌屬。

圖2 N1巨大芽孢桿菌屬Fig.2 N1 Bacillus megaterium

圖3 N2枯草芽孢桿菌屬Fig.3 N2 Bacillus subtilis

圖4 N3假單胞菌屬Fig.4 N3 Pseudomonas

圖5 N4酵母菌屬Fig.5 N4 Saccharomyces

2.2 菌株性能檢測

如圖6所示，其中枯草芽孢桿菌屬在鹽濃度超過50g/L時可繼續(xù)生長，較其他菌屬耐鹽含量高，其最適生長濃度為 45g/L左右；其次是巨大芽孢桿菌屬，鹽濃度達到 50g/L的培養(yǎng)液內(nèi)菌體數(shù)超過另外兩種，菌體數(shù)在鹽含量 30g/L時達到最高[9]，巨大芽孢桿菌總體生長情況不如枯草芽孢桿菌；假單胞菌屬和酵母菌屬的最適鹽濃度為 20g/L，過高的鹽濃度對它們的生長有毒害作用。

圖6 NaCl含量對各菌株生長影響Fig.6 Effect of NaCl content on growth of each strain

2.3 混合菌劑拮抗性能

實驗發(fā)現(xiàn)混合菌劑在肉胨培養(yǎng)基上和搖瓶內(nèi)(吸光度595nm檢測)4種微生物均生長良好，無拮抗性作用，可以混合使用。

2.4 單菌種對土壤pH恢復測定結(jié)果

單菌試驗結(jié)果如圖7至圖10所示。

圖7 巨大牙孢桿菌對土壤pH恢復測定Fig.7 Determination of soil pH recovery by Bacillus megaterium

圖8 枯草牙孢桿菌對土壤pH恢復測定Fig.8 Determination of soil pH recovery by Bacillus subtilis

圖9 酵母菌屬對土壤pH恢復測定Fig.9 Determination of soil pH recovery by Saccharomyces

圖10 假單胞菌屬對土壤pH回復測定Fig.10 Determination of soil pH recovery by Pseudomonas

表3 對照組pH變化測定Tab.3 Change of pH value in control group

以上各圖中 2至 8為起始設定土壤 pH分別為2、4、6、8、10、12、14 組的待測樣品。從數(shù)據(jù)結(jié)果可知：枯草芽孢桿菌對 pH的恢復是顯著的，在 pH呈酸性時恢復能力穩(wěn)定，能逐漸將其恢復到 pH 6以上并接近7的程度；而在pH呈堿性時恢復能力則較弱一些，隨著 pH的逐漸升高恢復能力減弱。巨大芽孢桿菌與其相似，但在 pH呈堿性時恢復能力上顯得更弱一些。而酵母菌與假單胞菌在pH為酸性時的恢復能力穩(wěn)定，但 pH呈堿性時恢復能力變?nèi)酰S著 pH的升高而降低。通過觀察對照組可知，在 pH土壤過酸的情況下，由于酸性物質(zhì)的自然揮發(fā)會使其 pH向平衡的一端轉(zhuǎn)移，但是若沒有微生物菌劑輔助的話，往往在某一個階段就停止變化。根據(jù)表 3對照組所示，堿性土壤或過堿土壤中的 pH則幾乎不隨時間變化而變化，很好地展示出了微生物對土壤的修復能力。其中枯草芽孢桿菌對土壤恢復能力最佳，其次為巨大芽孢桿菌，假單胞菌與酵母菌屬最弱。

2.5 復配菌種對培養(yǎng)基pH恢復能力測定結(jié)果

由圖 11可知，A方案的恢復能力在 pH呈酸性時恢復能力不錯，但在 pH呈堿性時弱于其他組。B方案與D方案對比A方案較強。但是C方案在pH呈酸性或堿性時，其恢復度都與其他 3組有明顯差異，在 pH呈酸性時穩(wěn)定上升，在 pH呈堿性時則與其他組不同，產(chǎn)生了顯著效果，使 pH下降迅速且穩(wěn)定。4種復配比例下的混合發(fā)酵中，對土壤 pH恢復能力為C＞B＞D＞A；最佳配比為枯草芽孢桿菌∶巨大芽孢桿菌∶假單胞菌∶酵母菌＝1∶2∶1∶1。

圖11 4個比例的復合菌劑pH恢復測定Fig.11 Determination ofpH recovery by four proportions of compound bacteria

3 討 論

本研究從天津靜海雞養(yǎng)殖場的糞便和鹽堿地中分離出4種對酸堿有抗性并能改良其pH值的菌屬，對其進行鏡檢觀察并對照《手冊》大致確定其為：枯草芽孢桿菌屬、巨大芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、酵母菌屬。在確定之后分別測定了 4種菌對酸堿土壤的恢復能力，并安排了對照組進行對比，最后確定枯草芽孢桿菌屬對土壤pH恢復的能力最佳。對混合菌劑開展了拮抗性試驗，發(fā)現(xiàn)菌劑在同一平板和同一搖瓶實驗中未顯示菌株間有拮抗性，菌株生長良好。

確定混合菌劑肥最佳復配比例，再以 1%接種量雞糞為原料來發(fā)酵微生物菌種，測定土壤 pH恢復值作為評價標準，最終確定了4種混合菌劑的最佳配比為 1∶2∶1∶1，在此比例下對土壤 pH 值恢復能力最佳。

由于實驗材料的限制，本研究用以發(fā)酵微生物菌肥的菌株篩選方法比較單一，需要多次重復的實驗過程才能得到高效株，過程繁瑣?？梢钥紤]結(jié)合化學誘變劑、等離子體誘變技術(shù)和基因組技術(shù)對菌株進行改造，獲得耐鹽性強的突變菌株。后續(xù)將嘗試運用誘變等方法盡可能篩選出更高效的菌株并再次測定，之后施入土壤并種植作物以測定更多數(shù)據(jù)。