張麗霞，劉書晶，張晨顏，虞力，范龔健

(1. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，南京 210014；2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3. 南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037)

桑葚系桑科桑屬植物桑(MorusalbaL.)的成熟果實，又稱桑果、桑棗，呈橢圓形黑色或者深紫色，自古享有“民間圣果”“中華果王”之美稱。研究表明，桑葚花色苷具有防止腦神經(jīng)老化、降血糖、降血脂、抗氧化、抗癌和增強機體免疫力等多種生物活性功能。桑葚酒是桑葚加工中常見的產(chǎn)品，具有營養(yǎng)豐富、酒體醇厚和香氣宜人等特點而備受消費者推崇[1-2]。桑葚酒渣中含有豐富的花色苷[3]，為桑葚果酒釀造中重要副產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤和保護心血管系統(tǒng)等生物學(xué)作用。然而，在桑葚酒釀造過程中產(chǎn)生的大量酒渣卻并未得到充分利用。

花色苷極易受到pH、溫度、氧、光照和金屬離子等因素的影響，其活潑的酚羥基容易被氧化成醌類物質(zhì)，限制了花色苷的使用[4-5]。花色苷與大分子物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)等結(jié)合，可以增加花色苷的穩(wěn)定性[6-7]。研究表明，納米粒子具有獨特的表面效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，通過將功能因子包裹于納米粒子內(nèi)部或吸附于納米粒子表面，能夠提高生物活性成分的穩(wěn)定性，促使其活性的最大發(fā)揮[8]。

雞卵白蛋白(OVA)由386個氨基酸組成，分子量約45 ku[9]。OVA可以通過疏水作用力與花色苷結(jié)合，因其具有更好的包埋效果，已被應(yīng)用于制備與具有生物活性小分子相互作用的模型蛋白[10]。蛋白類大分子可以提高功能活性成分的穩(wěn)定性[11]。Chen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，牛血清白蛋白(BSA)與藍莓花青素結(jié)合形成的納米顆粒，能提高其在模擬腸系統(tǒng)中的穩(wěn)定性。于情情等[13]發(fā)現(xiàn)，牛血清白蛋白提高了紫玉米花色苷和篤斯越桔花色苷的胃腸吸收穩(wěn)定性。Feng等[14]發(fā)現(xiàn)，以卵清蛋白和海藻酸鈉構(gòu)建的納米顆粒載體，可以提高姜黃素納米復(fù)合物的穩(wěn)定性、生物可利用度和抗氧化活性。目前，以O(shè)VA為壁材包埋桑葚酒渣花色苷制備納米顆粒、提高其穩(wěn)定性的研究未見報道。

筆者以桑葚酒渣花色苷為研究對象，考察OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的包埋率、外觀形態(tài)、粒徑和電勢分布和抗氧化活性，以及在模擬胃腸道消化液中的穩(wěn)定性，研究結(jié)果為桑葚酒渣花色苷的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚酒渣花色苷(MWPA)，實驗室自制，純度為83.52%，主要含有矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-蕓香糖苷；雞卵白蛋白，購自上海麥克林生化科技有限公司，純度為98.00%。

1.2 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒制備

參考文獻[15]方法，用pH 7.4磷酸鹽緩沖液配制1.5×10-4mol/L的OVA溶液，在70～90 ℃水浴中加熱15 min，冷卻至室溫后按照桑葚酒渣花色苷與OVA的摩爾比為0∶1,1∶1,2∶1,3∶1,4∶1和 5∶1 的比例加入桑葚酒渣花色苷，充分溶解后，采用1 mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.2～4.5，室溫條件下攪拌2 h，至OVA與桑葚酒渣花色苷結(jié)合完全。將溶液轉(zhuǎn)移至超濾離心管中(截留分子量為10 ku)，在4 500 r/min下離心15 min，去除未包封的桑葚酒渣花色苷，得到OVA-花色苷納米顆粒。

1.3 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒穩(wěn)定性及釋放

體外模擬胃腸道消化體系參照美國藥典并稍作調(diào)整[16]。模擬胃液主要由0.32%(質(zhì)量分數(shù))胃蛋白酶和0.20%(質(zhì)量分數(shù))NaCl組成，用鹽酸將pH調(diào)至1.2；模擬腸液主要由1.00%(質(zhì)量分數(shù))胰酶和0.68%(質(zhì)量分數(shù))K2HPO4組成，用NaOH將pH調(diào)至7.40。將OVA-花色苷納米顆粒加入模擬胃液和腸液，在37 ℃溫度、100 r/min下孵育，模擬胃液取樣時間為0，0.5，1.0，1.5和2.0 h，模擬腸液取樣時間為0，1，2，3和4 h，取樣后立即于520 nm處測量樣品的吸光度。

1.4 測定指標

1.4.1 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒包埋率

按照OVA-花色苷納米顆粒制備方法，取離心后的溶液1 mL定容至10 mL容量瓶中，采用消光系數(shù)法測定溶液中總花色苷濃度。包埋率計算公式如下：

(1)

式中：C為離心液中花色苷濃度，mol/L；V為超濾液總體積，L；m為納米顆粒制備過程中桑葚酒渣花色苷添加的摩爾質(zhì)量，mol。

1.4.2 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的微觀結(jié)構(gòu)

分別取桑葚酒渣花色苷與雞卵白蛋白摩爾比為0∶1和3∶1所制備的納米顆粒溶液30 μL于玻璃片上自然晾干待用。掃描電子顯微鏡觀察，工作電壓為10 kV。

1.4.3 OVA-花色苷納米顆粒粒徑及Zeta電勢

取不同比例的OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒用Nano-ZS90納米粒度儀測定粒徑和Zeta電勢，每個樣品重復(fù)3次，平衡時間2 min，累計次數(shù)100次。

1.4.4 自由基清除率

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率的測定采用陳培等[17]的方法，并稍作改進。分別加入15 μL樣品溶液、60 μL 0.05 mmol/L Tris-HCl和150 μL 0.15 mmol/L DPPH溶液于96孔板中混合反應(yīng)，避光放置30 min。用無水乙醇溶液作為顏色空白對照，磷酸鹽緩沖溶液為空白對照，在酶標儀上于520 nm波長處檢測吸光度大小，每個樣品重復(fù)3次。

2,2′-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基清除率參照劉龍云等[18]的方法并加以改進。將ABTS原液稀釋至吸光度為0.900±0.005。96孔板中每孔加入90 μL ABTS稀釋液和10 μL的樣品，放置4 min后用酶標儀檢測樣品在630 nm波長處的吸光度。所有操作避光條件下進行，每個樣品重復(fù)3次。自由基清除率計算公式如下：

(2)

式中：A對照為無水乙醇溶液的吸光度；A樣品為樣品的吸光度；A空白為磷酸鹽緩沖溶液的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.0軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Excel 2016軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的包埋率

桑葚酒渣花色苷添加量對納米顆粒包埋率的影響見圖1。由圖1可知，隨著桑葚酒渣花色苷和OVA摩爾比的不斷增加，OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒包埋率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這可能是由于制備體系中桑葚酒渣花色苷過量造成的。當花色苷與蛋白質(zhì)摩爾比為3∶1時，OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的包埋率達到最高，為82.34%?？赡艽藭r溶液帶有的正負電荷大約相等，凈電荷達到最小值，凝聚反應(yīng)最為充分，產(chǎn)生凝聚物達到最大值[11]，對花色苷的包埋也最為充分。

2.2 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的形態(tài)

OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的微觀形態(tài)見圖2。OVA分子在磷酸鹽緩沖液中開始形成球形顆粒，粒徑約為135～140 nm，顆粒也開始分散。加入桑葚酒渣花色苷以后，OVA球形顆粒迅速增多，顆粒形態(tài)較未加花色苷的有所減小，顆粒直徑從135～140 nm減小到40～45 nm，表明添加花色苷后粒徑減小，OVA發(fā)生了聚合。這一結(jié)果與姚惠芳等[7]報道在磷酸鹽緩沖液中添加花色苷后BSA粒徑變小的情況一致。

2.3 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的粒徑和電勢分布

OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的粒徑分布如圖3所示。由圖3可知，隨著花色苷與OVA的摩爾比增加，形成納米顆粒粒徑呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。不含花色苷的OVA顆粒粒徑約為120 nm，這與掃描電鏡的結(jié)果基本接近。根據(jù)馬鑫[19]的研究，可能是因為電鏡處理樣品時間稍長，樣品發(fā)生聚合，導(dǎo)致顆粒粒徑略有變大。隨著花色苷與OVA的摩爾比越高，OVA-花色苷納米顆粒逐漸減小，當花色苷與OVA摩爾比為5∶1時，粒徑約為40 nm，這與掃描電鏡的結(jié)果相同，說明加入花色苷后OVA發(fā)生了緊密的聚合。

圖3 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的粒徑分布Fig. 3 Size distribution of OVA-mulberry wine pomace anthocyanin nanoparticles

OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的電勢分布如圖4所示。在磷酸鹽緩沖液中OVA的電勢為-35 mV，隨著花色苷與OVA摩爾比的逐漸增高，OVA-桑葚酒渣花色苷的電勢逐漸降低，當摩爾比為5∶1時，OVA-花色苷納米顆粒的電勢最低，為-13 mV。這主要是由于OVA相對含量下降，溶液黏度隨之下降，從而導(dǎo)致Zeta電勢增加[20]。OVA-桑葚酒渣花色苷溶液Zeta電位絕對值增大時，表明OVA表面同性電荷增多，由于同性電荷間的相互排斥使OVA-桑葚酒渣花色苷溶液更穩(wěn)定。

圖4 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的電勢分布Fig. 4 Zeta potential of OVA-mulberry wine pomace anthocyanin nanoparticles

2.4 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的抗氧化活性

OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的抗氧化活性見圖5。由圖5a可知，當花色苷與OVA摩爾比逐漸增大時，DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先增大后極緩慢上升的趨勢。當摩爾比小于3∶1時，OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒清除DPPH能力隨著濃度比增加呈增加趨勢；當摩爾比大于3∶1時，隨著花色苷與OVA濃度增加，OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒清除DPPH自由基清除率無明顯增強。OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒清除ABTS自由基的能力與清除DPPH自由基規(guī)律一致(圖5b)。由此可見，在一定范圍內(nèi)提高花色苷的濃度可以增強對OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒自由基清除的能力，原因是單位體積內(nèi)花色苷B環(huán)酚羥基數(shù)目大，B環(huán)酚羥基可以與自由基發(fā)生反應(yīng)，形成氫鍵并穩(wěn)定，從而導(dǎo)致中斷自由基鏈的反應(yīng)[21]。

圖5 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒的抗氧化活性Fig. 5 Antioxidant activity of OVA-mulberry wine pomace anthocyanin nanoparticles

2.5 OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒模擬消化特性

OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒模擬胃腸道消化特性見圖6?；ㄉ杖芤涸?20 nm處有特征吸收，吸光度值越低，說明溶液中花色苷降解越嚴重。OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒和花色苷在模擬胃消化過程中較穩(wěn)定，模擬消化液520 nm處吸光度值緩慢下降，且兩者差異不顯著(P>0.05)。這與Reyes等[20]研究的花色苷在酸性條件下相對穩(wěn)定的結(jié)果一致。在模擬腸消化模型中，花色苷穩(wěn)定性較差，520 nm處吸光度值在2.0 h內(nèi)降低了83%，而2.0～4.0 h則保持不變，這是因為花色苷被氧化并生成了醌類物質(zhì)，不再具備花色苷的抗氧化性以及各種光譜特征等性質(zhì)，因此，在同樣的測試條件下無法被檢測[21]。González-Barrio等[22]報道花色苷在回腸內(nèi)分解后的含量下降60%，從而失去其特征吸收。OVA-桑葚酒渣花色苷納米顆粒在模擬腸消化過程中520 nm處吸光度值也在緩慢下降，4.0 h后的含量僅為初始的55%左右，但顯著高于未包埋的花色苷，由此可見，OVA包埋對桑葚酒渣花色苷有保護作用。

圖6 OVA-花色苷納米顆粒在體外消化模型中的穩(wěn)定性Fig. 6 Stability of OVA-mulberry winepomace anthocyanin nanoparticles in vitro digestion model

3 結(jié) 論

1)雞卵白蛋白可用于桑葚酒渣花色苷的納米顆粒制備。當花色苷與蛋白質(zhì)摩爾比為3∶1時，OVA能包埋最多的花色苷。桑葚酒渣花色苷與OVA在磷酸鹽緩沖液中能相互作用形成納米顆粒，粒徑為40～45 nm。OVA納米載體能顯著提高花色苷的抗氧化活性。

2)在pH為7.4的腸模型中，OVA納米載體可以增強花色苷的穩(wěn)定性，能夠提升其在人體內(nèi)的吸收利用。研究結(jié)果可解決桑葚釀酒過程中酒渣處理困難的問題，提高桑葚的綜合利用價值，對于推進桑葚系列產(chǎn)品的研發(fā)和桑葚產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義。