肖文浚，宋百靈，李心雨，李金芳，姜孝芳，李新霞*(.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 800；.新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊 800；.新疆醫(yī)科大學(xué)厚博學(xué)院，克拉瑪依 84000；4.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 800)

硫化氫是生物體內(nèi)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，不僅在神經(jīng)[1]、心血管[2]和消化系統(tǒng)[3]中有重要作用，還參與呼吸的生理調(diào)節(jié)及病理過(guò)程，對(duì)急慢性呼吸疾病有治療作用[4]。支氣管哮喘患者急性發(fā)作期血漿硫化氫水平明顯低于臨床緩解期，且隨著病情惡化，血漿硫化氫水平逐漸降低[5]。慢性阻塞性肺病(COPD)患者血清中硫化氫水平較健康者低，在COPD穩(wěn)定期患者血清中硫化氫水平有所升高[6]。

研究表明，大蒜辣素及其系列降解大蒜含硫化合物在體內(nèi)的生物活性作用是經(jīng)硫化氫介導(dǎo)的[7]。本課題組前期研究了大蒜含硫化合物，包括蒜氨酸、大蒜辣素、二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)和三硫二丙烯(DATS)在大鼠血液中的代謝、分布及藥代動(dòng)力學(xué)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)硫化氫是大蒜辣素在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，大蒜含硫化合物有望成為硫化氫的供體藥物[8-9]。

我國(guó)民間有用大蒜治療鼻炎的經(jīng)驗(yàn)方[10-11]，對(duì)感冒后鼻塞不通等有較好療效。Peter J[12]報(bào)道，大蒜辣素對(duì)變應(yīng)性鼻炎(AR)效果顯著。本實(shí)驗(yàn)所用大蒜提取物是將鮮蒜冷凍干燥制得的凍干蒜粉，保留了大蒜中除水分外的所有原始成分和蒜酶的活性，大鼠給藥前將大蒜提取物用蒸餾水配制成混懸液，此時(shí)大蒜中的蒜氨酸與蒜酶全部反應(yīng)轉(zhuǎn)化為大蒜辣素。本研究建立AR大鼠模型，考察大蒜含硫化合物對(duì)AR大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)、血清免疫球蛋白E(IgE)等生化指標(biāo)及鼻黏膜病理組織的影響，以闡明大蒜含硫化合物對(duì)AR的作用及其可能的機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 C2500-R-230V型高速離心機(jī)(美國(guó)萊伯特公司)；ICV-450型電熱恒溫培養(yǎng)箱(日本亞速旺公司)；Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]；ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀，ACQUITY?TQD型質(zhì)譜儀(美國(guó)沃特世公司)；5000 MWCO PES型超濾離心管(德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2試藥 大蒜提取物(批號(hào)20161201，蒜氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.9%，潛在大蒜辣素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%)，蒜氨酸(批號(hào)20081201，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92%)，新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司；鼻炎康片(批號(hào)16070)，國(guó)藥集團(tuán)德眾(佛山)藥業(yè)有限公司；卵清蛋白(OVA)，戊巴比妥鈉(批號(hào) 20160925)，美國(guó)Sigma公司；氫氧化鋁膠生理鹽水(批號(hào)20170309)，青海生物藥品廠有限公司；大鼠IgE、白細(xì)胞介素-5(IL-5)和白細(xì)胞介素-13(IL-13)酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)試劑盒以及一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)于Elabscience公司；大鼠嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白(ECP)Elisa試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；硫化鈉(批號(hào)20111009)，甲酸(批號(hào)20141209)和N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽(批號(hào)20140504)，均購(gòu)于天津市福晨化學(xué)試劑廠；乙酸鋅(批號(hào)20110103)，天津靜海大邱工業(yè)園；三氯化鐵(批號(hào)20111008)，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；亞甲基藍(lán)(批號(hào)20120725)，天津永晟精細(xì)化工有限公司。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量為180～220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(新)2016-0003。

2 方法

2.1AR大鼠分組、建模與給藥 將大鼠隨機(jī)分為6組：空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組以及大蒜提取物低、中、高劑量組，每組12只，每籠6只。采用OVA致敏的方法造模，OVA作抗原，氫氧化鋁作佐劑，將OVA溶解于氫氧化鋁膠生理鹽水制成混懸液，每只大鼠用1 mL質(zhì)量濃度為0.3 g·L-1的OVA生理鹽水腹腔注射，隔日1次，共10次，為基礎(chǔ)致敏。完成基礎(chǔ)致敏的次日用質(zhì)量濃度為50 g·L-1OVA的生理鹽水滴鼻攻擊雙側(cè)鼻腔，每側(cè)50 μL，每日1次，共12次，行為學(xué)評(píng)分總分超過(guò)5分即為造模成功?？瞻捉M用生理鹽水代替OVA進(jìn)行腹腔注射和滴鼻攻擊。

造模完成后開(kāi)始給藥，各劑量組藥液臨用現(xiàn)配。大蒜提取物低、中、高劑量組給藥量以蒜氨酸計(jì)分別為3.15，6.30，12.60 mg·kg-1，陽(yáng)性對(duì)照組給予鼻炎康藥量為466 mg·kg-1，按照每100 g灌胃1.0 mL給予藥液；空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水。除空白組外，其余各組每次給藥前30 min均用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的OVA生理鹽水進(jìn)行雙側(cè)滴鼻，每側(cè)50 μL，連續(xù)給藥10 d；空白組用等量生理鹽水滴鼻。

2.2行為學(xué)觀察 每次鼻腔致敏后行為學(xué)觀察30 min，記錄大鼠鼻涕量、噴嚏及鼻癢次數(shù)，采用疊加法記分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1，總分超過(guò) 5分者為造模成功。隔日記錄大鼠行為學(xué)得分，計(jì)算總分。

表1 大鼠AR癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3樣品采集與測(cè)定

2.3.1樣品的采集 血清采集：藥物干預(yù)結(jié)束后，禁食12 h，稱定大鼠體質(zhì)量，以質(zhì)量濃度為20 g·L-1的戊巴比妥鈉麻醉，取腹主動(dòng)脈血3～4 mL，以3 000 r·min-1離心15 min，取上層血清，置于-80 ℃保存。鼻黏膜取樣：麻醉大鼠取血后處死，取鼻中隔黏膜，置于體積分?jǐn)?shù)為4%的甲醛中固定。其他組織取樣：處死大鼠后，取心臟、肝小葉、脾臟、左肺、左腎和腦組織各0.2 g，置于凍存管中，-80 ℃保存。

2.3.2血液指標(biāo)檢測(cè) 取血清樣本，用Elisa法分別檢測(cè)IgE、ECP、IL-5及IL-13水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)NO水平。

2.3.3鼻黏膜病理組織學(xué) 鼻中隔黏膜組織脫鈣處理72 h，脫水、包埋、切片、烤片，蘇木精-伊紅(HE)染色，高倍鏡下觀察組織學(xué)變化。

2.3.4大鼠血清及各組織中硫化氫水平的測(cè)定 采用UPLC-MS/MS法測(cè)定大鼠血清與組織中硫化氫的水平[8]。

2.3.4.1色譜條件 色譜柱為Waters ICQUITY UPLCBEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：1 mL·L-1甲酸-乙腈(47∶53)；柱溫：40 ℃；流速：0.15 mL·min-1；進(jìn)樣量：2 μL。

2.3.4.2質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子化方式為電噴霧離子化(ESI)，離子極性為正離子；毛細(xì)管電壓：3 kV；錐孔電壓：20 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶溫度：350 ℃；氬氣流速：50 L·h-1；氮?dú)饬魉伲?98 L·h-1。

2.3.4.3血液前處理 取血液樣品，離心，取上清液100 μL，加乙腈200 μL，渦旋混勻，離心10 min，取上清液250 μL，置于超濾離心管中，離心，取超濾液100 μL，按照文獻(xiàn)方法[8]依次加醋酸鋅、N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽和三氯化鐵，渦旋，室溫靜置，用UPLC-MS/MS法進(jìn)行分析。

2.3.4.4組織樣品前處理 取大鼠組織0.1 g，置于2 mL離心管中，加生理鹽水450 μL，勻漿離心，取上清液100 μL，加乙腈200 μL，渦旋混勻，離心，取上清液250 μL，置于超濾離心管中，離心，取超濾液100 μL，依次加醋酸鋅、N，N-二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽和三氯化鐵各100 μL，渦旋，室溫靜置，用UPLC-MS/MS法進(jìn)行分析。

2.3.4.5掃描方式及定量離子選擇 分別進(jìn)行大鼠空白血清和給藥后含藥血清、組織樣品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜選擇性掃描。樣品中硫化氫衍生化生成穩(wěn)定的亞甲藍(lán)，其一級(jí)電離產(chǎn)生的碎片離子的相對(duì)分子質(zhì)量為283.81，但衍生化試劑對(duì)生成的亞甲藍(lán)有干擾。該碎片離子進(jìn)一步二級(jí)電離產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量分別為268.27，240.28的2個(gè)碎片離子，但相對(duì)分子質(zhì)量為240.28的碎片離子進(jìn)行定量時(shí)儀器響應(yīng)較小，故采用二級(jí)質(zhì)譜選擇性掃描(MRM)，選擇m/z=268.27為定量離子。

3 結(jié)果

3.1對(duì)AR大鼠行為的影響 造模階段除空白組外，其他各組大鼠在第8次鼻腔給予OVA后，均出現(xiàn)抓鼻、流涕等AR癥狀，第12次滴鼻后，空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組以及大蒜提取物低、中、高劑量組行為學(xué)評(píng)分分別為(1.3±0.4)，(6.3±1.3)，(6.8±1.1)，(6.8±1.1)，(6.7±1.4),(6.2±1.3)分，各造模組總分均大于5分，與空白組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，提示造模成功。給藥6～10 d后，大蒜提取物低、中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠AR癥狀均較模型組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。給藥第10天，大蒜提取物低、中和高劑量組幾乎無(wú)鼻涕，僅有輕微抓鼻動(dòng)作，偶見(jiàn)噴嚏，而陽(yáng)性對(duì)照組仍有少量清涕，輕微抓鼻動(dòng)作，偶見(jiàn)噴嚏。

表2 大蒜提取物給藥對(duì)AR大鼠鼻部癥狀評(píng)分的影響

3.2對(duì)AR大鼠血清IgE、ECP、IL-5、IL-13和NO水平的影響 見(jiàn)表3。由表3可知，模型組血清中IgE水平明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和大蒜提取物中劑量組血清中IgE水平均較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大蒜提取物低、高劑量組血清IgE水平與模型組相比略有下降，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組血清中ECP水平明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和大蒜提取物低劑量組血清ECP水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明血清中ECP的釋放被明顯抑制；大蒜提取物中、高劑量組血清中ECP水平略低于模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組血清IL-5和IL-13水平明顯高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和大蒜各劑量組血清IL-5與IL-13水平均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明陽(yáng)性對(duì)照組和大蒜提取物低、中、高劑量組的血清IL-5與IL-13水平均明顯降低，其中大蒜提取物低劑量組IL-5水平相對(duì)模型組降幅最大，達(dá)60.2%。模型組NO水平明顯高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；陽(yáng)性對(duì)照組和大蒜提取物低劑量組NO水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；大蒜提取物中、高劑量組NO水平與模型組相比略有降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 大蒜提取物給藥對(duì)AR大鼠血清IgE、ECP、IL-5、IL-13和NO水平的影響

3.3對(duì)AR大鼠鼻黏膜病理組織學(xué)的影響 見(jiàn)圖1。由圖1可知，空白組大鼠僅見(jiàn)少量鼻黏膜充血及腺體增生，鼻黏膜下固有層內(nèi)偶見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)；模型組大鼠鼻黏膜充血，血管擴(kuò)張，腺體增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，鼻黏膜下固有層內(nèi)有大量EOS；陽(yáng)性對(duì)照組大鼠鼻黏膜病理學(xué)改變均有所減輕，可見(jiàn)散在的炎性細(xì)胞和EOS；大蒜提取物低、中、高劑量組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)改變均減輕，可見(jiàn)散在的炎性細(xì)胞和EOS。

圖1 組織病理學(xué)染色(HE，×400)

3.4AR大鼠血清及各組織中硫化氫水平 末次給藥后,取空白組和大蒜提取物高劑量組大鼠的血清、心、肝、脾、肺、腎和腦組織，用UPLC-MS/MS法測(cè)定硫化氫水平，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，2組大鼠血清、心、肝、脾和腎中硫化氫水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；大蒜提取物高劑量組的肺和腦組織中硫化氫水平均高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 末次給藥后大蒜提取物高劑量組與空白組血清及各器官中硫化氫水平比較

4 討論

本研究采用AR模型大鼠研究大蒜提取物對(duì)AR的作用，病理組織結(jié)果表明，各給藥組與模型組大鼠相比，鼻黏膜充血、血管擴(kuò)張、腺體增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度均有明顯改善。

AR是機(jī)體暴露于變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。IgE是在AR發(fā)病的病理、生理過(guò)程中起關(guān)鍵作用的特異性抗體[13-14]，抑制IgE的產(chǎn)生并降低其水平是治療AR的重要手段。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予大蒜提取物后血清IgE水平降低，鼻炎癥狀改善。EOS浸潤(rùn)是Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的重要特征，EOS的生物學(xué)功能主要通過(guò)其脫ECP等顆粒實(shí)現(xiàn)，AR患者的EOS代謝活性增強(qiáng)導(dǎo)致血清中ECP水平增高[15]。本研究中，給藥后的大鼠鼻黏膜病理切片明顯觀察到EOS減少，同時(shí)檢測(cè)到血清ECP水平下降，說(shuō)明大蒜提取物可抑制EOS的募集從而改善炎癥反應(yīng)。AR是由輔助性T細(xì)胞1/輔助性T細(xì)胞2(Th1/Th2)免疫反應(yīng)失衡引起的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，IL-5和IL-13屬于Th2細(xì)胞因子，是免疫反應(yīng)的特異性指標(biāo)[16]，給予大蒜提取物后，IL-5和IL-13水平均降低，通過(guò)AR的負(fù)向調(diào)節(jié)恢復(fù)了Th1/Th2免疫平衡。研究發(fā)現(xiàn)，AR等許多Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病局部及全身血液中NO水平均升高[17]，NO在AR速發(fā)和遲發(fā)相反應(yīng)中均起重要的促炎作用[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜提取物能抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)產(chǎn)生NO，減輕AR炎癥程度。

目前，國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的大蒜活性成分是大蒜辣素及其系列含硫有機(jī)化合物[19]。課題組前期實(shí)驗(yàn)表明，大蒜辣素尾靜脈注射給藥后在小鼠體內(nèi)未測(cè)到原型，但可測(cè)到其代謝指標(biāo)成分硫化氫，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)K=0.086 min-1，t1/2=8.926 min，tmax=15.000 min[8]，本實(shí)驗(yàn)采用大蒜提取物，蒜氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.9%，口服給藥時(shí)已轉(zhuǎn)化為大蒜辣素，于大蒜提取物末次給藥20 h后取大蒜提取物高劑量組大鼠，采用UPLC-MS/MS法測(cè)定各組織中硫化氫的水平，其肺和腦組織中硫化氫水平均高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。文獻(xiàn)報(bào)道，在肺組織及肺血管中胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表達(dá)較高[20]，可催化裂解含硫化合物產(chǎn)生的硫化氫高于其他組織，也提示大蒜提取物對(duì)呼吸系統(tǒng)疾病有較好的預(yù)防和治療作用。研究表明，外源性硫化氫能降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-5、IL-13和EOS等炎性細(xì)胞的水平[21]。Rose P等[22-23]綜述近幾年研究人員已經(jīng)公認(rèn)的大蒜含硫化合物在體內(nèi)通過(guò)硫化氫介導(dǎo)作用于多個(gè)通道，如離子通道、轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等，發(fā)揮抗炎與免疫調(diào)節(jié)作用。根據(jù)硫化氫藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)推測(cè)大蒜提取物中的大蒜辣素在體內(nèi)產(chǎn)生硫化氫，通過(guò)降低IL-5和IL-13等促炎因子水平、抑制iNOS-NO通路，發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)作用，從而減輕AR癥狀。

AR是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)外部刺激而產(chǎn)生的氣道炎癥變態(tài)反應(yīng)，使用激素類藥物會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。大蒜是目前已知的富含硫化物的天然藥食兼用植物，由大蒜衍生的含硫化合物在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有重要的生物化學(xué)和生理學(xué)作用，如細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)、細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)[24]、抗炎作用[25]和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)[26]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，大蒜及其含硫化合物可作為天然的硫化氫供體，可用于AR等氣道急慢性炎癥性疾病的治療或預(yù)防。