費媛媛 焦碩 陸雅海

中國東部水稻土壤丁酸互營降解微生物的地理分布格局

費媛媛 焦碩 陸雅海?

北京大學城市與環(huán)境學院, 北京 100871; ?通信作者, E-mail: luyh@pku.edu.cn

沿緯度梯度收集中國東部 34 個水稻土壤樣品, 在實驗室條件下, 以丁酸鈉為底物, 進行二次厭氧富集實驗。運用微生物高通量測序技術, 分析樣地水稻土壤中丁酸互營降解過程的微生物群落特征、功能活性及互營單胞菌相對豐度地理分布格局。結果表明, 丁酸降解產(chǎn)甲烷的延滯期(3~14 天)隨著樣地緯度的升高而加長, 但最大產(chǎn)甲烷速率沒有顯著的差異。環(huán)境因子相關分析結果表明, 丁酸降解細菌的關鍵類群為互營單胞菌(), 互營單胞菌的相對豐度主要受年平均溫度(MAT)的影響?；I單胞菌相對豐度較大的樣地, 丁酸完全降解所需時間較短。丁酸互營降解微生物的群落結構表現(xiàn)出顯著的距離衰減關系(<0.05), 表明微生物群落的構建同時受到空間距離和環(huán)境因子的驅動。

丁酸降解; 產(chǎn)甲烷; 互營單胞菌相對豐度; 微生物地理分布

甲烷(CH4)氣體的排放源較為復雜, 大致分為自然排放源和人為排放源。農業(yè)排放源約占人為排放源的 14%以上[1], 其中水稻土壤是主要的農業(yè)排放源之一。水稻土壤中有機物厭氧降解產(chǎn)生甲烷的過程主要分為 3 個階段。首先, 植物殘體等有機質大分子在初級發(fā)酵菌作用下分解成小分子物質(如脂肪酸和醇類等); 然后, 在次級發(fā)酵菌(又稱互營細菌)的作用下, 小分子物質進一步分解成乙酸、H2和 CO2等甲烷前體物質; 最后, 在產(chǎn)甲烷菌的作用下, 甲烷前體物質轉化成 CH4[2–3]。最復雜的環(huán)節(jié)為短鏈脂肪酸的厭氧降解, 丁酸是有機物降解的重要中間產(chǎn)物之一[4]。本文將丁酸通過厭氧降解產(chǎn)生CH4的過程簡稱為丁酸互營降解。

在熱力學條件限制下, 丁酸互營降解過程是互營細菌和產(chǎn)甲烷古菌共同作用的結果[2], 其中的互營細菌主要為互營單胞菌科 Syntrophomonadaceae。Zou 等[5]的研究表明, 水稻土壤中參與丁酸互營降解的產(chǎn)甲烷古菌主要為甲烷八疊球菌科(Methano-sarcinaceae)和甲烷胞菌目(Methanocellales)。通常認為, H2和甲酸鹽是丁酸互營氧化過程中的主要電子載體, 但我們在前期的研究中發(fā)現(xiàn)導電特性納米材料(如納米磁鐵礦和碳納米管)可以顯著地促進丁酸互營氧化, 推測可能存在直接種間電子傳遞作用(direct interspecies electron transfer, DIET)[6]。水稻土壤和湖泊底泥等缺氧環(huán)境中參與丁酸鹽降解和CH4生成的互營細菌主要為互營單胞菌和地桿菌(), 產(chǎn)甲烷古菌為甲烷八疊球菌、甲烷胞菌和甲烷桿菌(s)等[7–9]。

研究微生物群落的地理分布格局, 旨在探索它們的棲息地、數(shù)量和多樣性等特征及機理[10]。距離衰減關系(distance?decay relationship, DDR)常用于表征微生物的生物地理模式, 表示微生物群落相似性隨著地理距離的增加而降低, 體現(xiàn)群落的多樣性在空間尺度上的變化[11]。一般來說, 對微生物群落產(chǎn)生影響的環(huán)境因子主要有溫度、pH、鹽度和地理距離等[12]。另外, 在丁酸互營降解過程中, 丁酸鹽氧化菌受到熱力學條件限制[2], 因此不但難以被分離培養(yǎng), 而且在土壤微生物群落中占比很小, 使得原位研究的難度較大。

本文從我國東部主要稻米生產(chǎn)區(qū)采集 34 個水稻土壤樣品, 通過實驗室培養(yǎng)和分子生態(tài)學技術相結合的方法, 研究水稻土壤丁酸互營降解過程及關鍵微生物種類的地理分布特征, 旨在為預測不同地區(qū)水稻土壤中有機質厭氧分解、丁酸等脂肪酸中間產(chǎn)物的動態(tài)變化以及甲烷排放的空間變異特征提供科學依據(jù)。研究內容包括: 1)通過觀察不同地點水稻土壤的產(chǎn)甲烷延滯期、最大產(chǎn)甲烷速率及丁酸完全降解時間, 探究丁酸互營降解過程的區(qū)域地理特征; 2)探究丁酸互營降解微生物的地理分布格局及環(huán)境因子的影響。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品采集和分析

于水稻種植季節(jié)(2017 年 7—9 月), 沿緯度梯度自北向南, 從我國東部稻米主要生產(chǎn)區(qū)(108.8885°—126.9806°E, 18.4466—46.6135°N)采集 34 個耕作層樣品。在每個樣地隨機選取 3 個采樣點(每個采樣點的面積均為 100m2), 依據(jù)五點采樣法, 在每個采樣點對角線的中點及外圍四處(與中點距離相等), 在 0~15cm 深度范圍內采取 5 個土壤樣本, 保證每個土壤樣本的采樣深度及采樣量均勻。先將每個采樣點的 5 個樣品混合, 再將 3 個采樣點的土壤樣本混合, 成為該樣地最終的土壤樣本。將樣本運回實驗室, 置于 4℃冰箱內保存[13]。一部分樣品在室溫下自然風干, 用 2.0mm 篩子去除植物根系和石頭等殘留物, 用于土壤理化性質的分析。

用標準土壤試驗方法[14]分析土壤樣本的物理化學特性, 包括 pH、陽離子交換量(CEC)、有機質含量(OM)、溶解性有機碳(DOC)、微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)、硝態(tài)氮(NO3?)和銨態(tài)氮(NH4+)、總氮(TN)和有效氮(AN)、總磷(TP)和有效磷(AP)、總鉀(TK)和有效鉀(AK)、總硫(TS)和有效硫(AS)、總錳(TMn)和有效錳(AMn)、總銅(TCu)和有效銅(ACu)、總鐵(TFe)和有效鐵(AFe)、總鋅(TZn)和有效鋅(AZn)。此外, 從 WorldClim 數(shù)據(jù)庫(https://www.worldclim.org/)獲得 34 個樣地的氣候數(shù)據(jù), 包括年平均溫度(mean annual tempera- ture, MAT)和年平均降水量(mean annual precipita-tion, MAP)[13]。

1.2 丁酸互營降解厭氧培養(yǎng)實驗

取適量土壤樣本于燒杯中, 按照水土比 5:1 (質量/體積)制備土壤懸浮液, 每個土壤樣本設置 3 個平行實驗。首先, 將攪拌均勻的土壤懸浮液置于100mL 西林瓶中, 充入純度為 99.999%的 N2, 置換瓶內氣體, 氣體置換完畢后, 給每個培養(yǎng)瓶塞上丁基膠塞, 蓋上鋁蓋, 并用封口器封口。然后, 向每個培養(yǎng)瓶中注入 5mmol 的丁酸鈉溶液, 再次充入純N2進行氣體置換, 之后將培養(yǎng)瓶放置于 30℃恒溫箱中, 開始第一次富集培養(yǎng)實驗。土壤懸浮液中的丁酸鈉被完全降解后, 再次向培養(yǎng)瓶中注入 5mmol丁酸鈉溶液, 氣體置換完畢后放置于 30℃恒溫箱中, 進行第二次富集培養(yǎng)實驗。

將 5mmol 丁酸開始降解至其消耗結束所需時間定義為富集培養(yǎng)時間, 不同樣地的培養(yǎng)時間各不相同, 第一代培養(yǎng)時間為 11~22 天, 第二代培養(yǎng)時間比第一代短, 為 4~10天。在富集培養(yǎng)前期, 為了更精確地測定其產(chǎn)甲烷延滯期, 平均間隔 1 天測定一次 CH4濃度。在富集培養(yǎng)中后期, 平均間隔 2 天測定一次 CH4濃度。每一代富集培養(yǎng)丁酸濃度的測定次數(shù)為 4~5 次。

本研究對丁酸互營降解過程的特征設置 3 個分析指標: 1)產(chǎn)甲烷延滯期, 即從實驗開始到 CH4濃度呈線性增加的時間[10]; 2)利用產(chǎn)甲烷曲線的斜率計算第二代最大產(chǎn)甲烷速率(mmol/d); 3)第二代丁酸完全降解所需時間。

1.3 微生物群落分析和統(tǒng)計方法

1.3.1 16S rRNA 高通量測序分析

富集培養(yǎng)實驗結束后, 利用土壤 DNA 快速提取試劑盒(Fast DNA?Spin Kit for Soil, MP, 美國)提取土壤樣本的 DNA, 操作步驟按試劑盒說明書進行。細菌的引物為 338F: 5’-ACTCCTACGGGAGG AGCA-3’; 806R: 5’- GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3’[15]。古菌的引物為1106F: 5’-TTWAGTCAGGC AACGAGC-3’; 1378R: 5’-TGTGCAAGGAGCAGG GAC-3’[16]。微生物群落的高通量測序由廣東美格基因科技有限公司完成, 在Illumina Hi-Seq 2500 平臺(Illumina Inc, San Diego, 美國)進行分析。利用USEARCH (v8.0.1517, http://www.drive5.com/usear ch/)進行序列分析, 同時使用UPARSE pipeline, 將相似性≥97%的序列定義為相同 OTU (operational taxonomic unit)[17], 之后篩選出每個 OTU 的代表性序列進行系統(tǒng)發(fā)育分類和統(tǒng)計分析。

1.3.2統(tǒng)計分析

采用一元線性回歸法, 分析丁酸完全降解時間與互營單胞菌()相對豐度之間的關系。在丁酸完全降解時間與互營單胞菌相對豐度的散點圖上添加趨勢線, 獲得二者的回歸方程。通過DDRs 來衡量微生物群落的擴散限制情況。利用 R v3.5.1 語言軟件(http://www.r-project.org/), 基于微生物群落的 Bray-Curtis 距離和樣地間地理距離兩項指標, 對 DDRs 進行分析[18]。通過冗余分析(redun-dancy analysis, RDA)和主坐標約束分析(canonical analysis of principal coordinates, CAP), 分別探討微生物地理分布格局和環(huán)境因素的影響。利用 ordi-R2step 函數(shù)選出有顯著影響的環(huán)境因子(<0.05)[19], 最后進行繪圖。

利用 R v3.5.1 中的“maps”包繪制樣地地圖[20]。利用 R 軟件“vegan”包里的“reg”函數(shù)進行線性回歸計算, 獲得互營單胞菌相對豐度與環(huán)境因子之間的關系。

為了探索微生物之間的共現(xiàn)性模式, 我們利用“Igraph”包[21]和 The Open Graph Viz 平臺[22]進行共發(fā)生網(wǎng)絡分析。在共發(fā)生網(wǎng)絡圖中, 每一個節(jié)點表示一個菌屬。在相關系數(shù)>0.6,<0.01 的情況下, 認為共發(fā)生事件是有效的[23]。共發(fā)生網(wǎng)絡參數(shù)主要包括平均度、節(jié)點數(shù)、邊數(shù)、圖密度和模塊化指數(shù)等。

2 研究結果

2.1 丁酸互營降解過程的特征及微生物群落的組成

通過高通量測序和抽平處理后, 對細菌共測得約 13200 個 OTUs, 并劃分為 80 個科, 其中最常見的 OTUs (科水平)為 Anaerolineaceae (6.1%), Syntro-phomonadaceae(5.1%)和 Xanthobacteraceae (2.4%), 相對豐度最高的菌屬(屬水平)為(5.1%)。對古菌測得約 1004 個 OTUs, 劃分為 13 個科, OTUs (門水平)分別為 Euryarchaeota(84.8%)和Thaumarchaeota (12.8%), 相對豐度最高的菌屬(屬水平)為(21.5%)。

丁酸互營降解過程具有以下特征: 1) 產(chǎn)甲烷延滯期隨著緯度升高而加長(圖 1); 2)相對豐度較大的樣地, 丁酸完全降解所需時間較短(圖 2)。

2.2 丁酸互營降解微生物的地理分布格局

丁酸互營降解微生物群落表現(xiàn)出顯著的距離衰減關系(斜率=?0.011)(圖 3), 表明微生物群落的構建同時受到空間距離和環(huán)境因子的驅動。為了進一步探究環(huán)境因子對微生物群落的驅動作用, 基于微生物群落的 Bray-Curtis 距離進行 CAP 分析, 結果如圖 4 所示。環(huán)境因子都具有顯著影響(<0.05), 溫度(MAT)和土壤 pH 對微生物群落產(chǎn)生重要的影響(圖4(a1)和(b1))。通過 RDA 分析, 進一步探究不同環(huán)境因子對優(yōu)勢微生物(屬水平)的影響, 結果表明, 對于細菌群落,和受MAT 和土壤 NH4+的影響最大(圖 4 (a2)); 對于古菌群落, 產(chǎn)甲烷菌(,等)和一些其他古菌(_,_等)受 pH 和 AN的影響較大(圖 4(b2))。

灰色柱子表示延滯期的相對值, 柱子越高, 其值越大

圖2 丁酸完全降解時間與菌屬互營單胞菌(Syntropho-monas)相對豐度的關系

2.3 丁酸互營降解微生物對產(chǎn)甲烷延滯期和最大產(chǎn)甲烷速率的影響

產(chǎn)甲烷延滯期和最大產(chǎn)甲烷速率取決于微生物群落的結構和功能。Spearman 相關性分析結果表明, 對于古菌群落(圖 5(a)),,,,和_的相對豐度均與產(chǎn)甲烷延滯期負相關, 即菌屬的相對豐度越大, 產(chǎn)甲烷延滯期越短, 但和_的相對豐度與產(chǎn)甲烷延滯期呈正相關。,,_和的相對豐度均與最大產(chǎn)甲烷速率正相關, 其中與最大產(chǎn)甲烷速率顯著正相關(= 0.42,<0.05)。

對于細菌群落(圖5(b)),,,,和的相對豐度均與產(chǎn)甲烷延滯期正相關, 但,和的相對豐度與產(chǎn)甲烷延滯期負相關。此外,的相對豐度與最大產(chǎn)甲烷速率顯著正相關(= 0.27,<0.05)。

2.4 互營單胞菌作為丁酸降解的關鍵類群

丁酸互營降解過程中,對丁酸的降解起關鍵作用, 在細菌群落中其相對豐度最大。圖6展現(xiàn)的地理分布格局, 可以看到南部樣地中的相對豐度明顯大于北部樣地。為了進一步探究這種地理分布格局產(chǎn)生的原因, 本文利用線性回歸方法分析環(huán)境因子對相對豐度的影響。圖7顯示, 溫度(MAT)和NH4+對的相對豐度產(chǎn)生顯著的正面影響(<0.05)。

圖3 水稻土壤丁酸互營降解微生物群落的距離衰減關系

(a1)和(a2)細菌; (b1)和(b2)古菌。1.Syntrophomonas; 2.Geobacter; 3.Anaeromyxobacter; 4.ADurb.Bin063.1; 5.Anaerolinea; 6.Candidatus_Solibacter; 7.Gaiella; 8.Pseudarthrobacter; 9.Bacillus; 10.Methanoregula; 11.Methanosaeta; 12.Candidatus_Methanoperedens; 13.Methanospirillum; 14.Methanosarcina; 15.Methanobacterium; 16.Methanocella; 17.Candidatus_Nitrososphaera; 18.Candidatus_Nitrocosmicus

圖5 最大產(chǎn)甲烷速率和產(chǎn)甲烷延滯期與丁酸互營降解微生物的相關性分析結果

灰色柱子表示Syntrophomonas相對豐度的的相對值, 柱子越高, 其值越大

本文通過共發(fā)生網(wǎng)絡分析, 探究丁酸互營降解微生物間的共存模式。如圖 8 所示, 網(wǎng)絡圖具有 75個節(jié)點和 158 條邊, 每個節(jié)點代表一個菌屬。網(wǎng)絡圖的平均度為 4.213, 圖密度為 0.057, 模塊化指數(shù)為 0.662。其中, Proteobacteria, Actinobacteria, Ch-loroflexi 和 Firmicutes 為細菌的優(yōu)勢菌門, Euryarchaeota 為古菌的優(yōu)勢菌門。關鍵分類單元主要包括,,和(圖 8(a))。模塊 1 主要由丁酸互營氧化菌、產(chǎn)甲烷菌和硝化菌組成, 進一步證明丁酸互營降解過程中互營代謝的重要性(圖 8(b))。

3 討論與結論

3.1 結論

1)丁酸互營降解過程具有以下特征: 產(chǎn)甲烷延滯期隨著緯度的升高而增大; 最大產(chǎn)甲烷速率沒有表現(xiàn)出明顯的地理分布差異; 互營單胞菌()相對豐度較大的樣地, 其丁酸完全降解所需時間較短; 互營細菌的相對豐度呈現(xiàn)中國南部明顯高于北部的地理分布格局, 環(huán)境因子溫度對其有關鍵性影響。

圖7 互營單胞菌(Syntrophomonas)相對豐度與環(huán)境因子的相關性分析結果

2)丁酸互營降解微生物群落的地理分布格局具有顯著的距離衰減關系, 其中細菌群落更加明顯, 表明微生物群落的構建同時受到空間距離和環(huán)境因子的驅動。

本文分析了丁酸互營降解過程的特征, 揭示了丁酸互營降解微生物的地理分布格局, 研究結果有助于預測不同樣地的有機質厭氧分解特性和產(chǎn)甲烷潛力, 為減少 CH4排放提供科學依據(jù)。

3.2 討論

本研究針對丁酸互營降解過程共測定 3 個指標。由于第二代已經(jīng)歷一次富集培養(yǎng), 產(chǎn)甲烷延滯期大大縮短, 因此采用第一代的產(chǎn)甲烷延滯期進行相關分析。每代的富集培養(yǎng)實驗中, 丁酸鹽濃度平均測定 4~5 次, 由于測定次數(shù)較少, 無法計算丁酸最大降解速率, 因此用丁酸完全降解所需時間來表征丁酸降解過程。

(a)根據(jù)微生物門分類對節(jié)點著色; (b)根據(jù)模塊分類對節(jié)點著色。圖例中括號內數(shù)字為節(jié)點個數(shù)

丁酸完全降解所需時間的分析中排除了兩個異常點, 分別是 HD (邯鄲, 14 天)和TJ (天津, 13 天)。實驗方法部分有關第一代和第二代培養(yǎng)時間的論述中也排除了這兩個異常點。兩個異常點的產(chǎn)生可能是由于該地點中互營細菌(如)的相對豐度都較高, 而產(chǎn)甲烷古菌的相對豐度相對較低, 相對豐度的差異導致互營效率不一致。

本研究發(fā)現(xiàn)的相對豐度隨著溫度的升高而增大(圖 7),相對豐度的地理分布格局也符合這一規(guī)律(圖 6), 這是由于南部低緯度地區(qū)溫度較高, 導致相對豐度明顯高于北部地區(qū)。與此相對應, 中國南部地區(qū)產(chǎn)甲烷延滯期低于北部地區(qū), 也是由于南部地區(qū)水稻土壤溫度相對較高, 土壤中的活性較強, 導致產(chǎn)甲烷延滯期較短。

本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境因子 pH 和溫度對丁酸互營降解微生物群落有重要影響(圖 4), 可能由于 pH 是影響土壤有機物降解的關鍵, 會影響底物利用的有效性[24]。另外, 由于的熱力學限制特性, 因此溫度對其相對豐度有顯著的影響[25]。丁酸降解產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸的過程為吸能反應, 受到熱力學的限制不能自發(fā)地進行[25], 溫度升高則有利于緩解熱力學限制。這可能是互營單胞菌的相對豐度隨緯度升高而降低的主要原因。

鑒于上述的熱力學限制特性, 開展實驗前, 我們預測溫度可能對相對豐度的地理分布格局產(chǎn)生較強的影響。為了驗證這種預測, 本文僅對丁酸降解的關鍵類群展開分析, 對產(chǎn)甲烷的關鍵類群則沒有做詳細的論述。在未來的研究中, 可對產(chǎn)甲烷的關鍵類群進行分析。

丁酸互營降解過程中, 互營細菌與產(chǎn)甲烷古菌之間通常形成團聚體, 以便維持較短的種間距離來保證丁酸的有效降解[26–27]。為了克服該過程中的熱力學限制, 產(chǎn)甲烷古菌起到至關重要的作用[2]。本文通過共發(fā)生網(wǎng)絡分析, 探究水稻土壤中丁酸互營降解微生物的共存模式, 互營細菌和產(chǎn)甲烷古菌被歸為同一個模塊, 說明微生物類群之間有著密切的互營代謝關系。

本研究采用年平均溫度表示樣地的溫度。實際上, 土壤溫度是影響土壤微生物更直接的指標。在未來的工作中, 擬通過直接測定土壤溫度來探究溫度對微生物群落的影響。

致謝 研究工作得到中國科學院南京土壤研究所褚海燕研究員和馮毛毛同學的幫助, 謹致謝意。

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Biogeographic Patterns of Microbial Communities Associated with Syntrophic Butyrate Degradation in Paddy Soils in Eastern China

FEI Yuanyuan, JIAO Shuo, LU Yahai?

College of Urban and Environmental Sciences, Peking University, Beijing 100871; ? Corresponding author, E-mail: luyh@pku.edu.cn

The authors collected 34 paddy soil samples along the latitude from eastern China. Enrichment experiment was conducted under anaerobic conditions with sodium butyrate as the sole substrate. The authors investigated the microbial community characteristics and the functional activity of syntrophic butyrate degradation and the biogeographic patterns of relative abundance ofin these soils by Illumina sequencing of 16S rRNA genes. The lag phase of CH4production (3–14 days) increased towards higher latitudes, whereas the maximum rate of CH4production did not. The correlation analysis on influencing factors revealed that-was the key syntrophic bacterial taxon associated with butyrate degradation and its relative abundance was significantly influenced by mean annual temperature (MAT). The sampling sites with a relatively high abundance ofhad a shorter time for the complete degradation of butyrate. Distance-decay patterns cha-racterized by a steeper slope were found in microbial communities associated with syntrophic butyrate degradation (<0.05), indicating that the construction of microbial communities was driven by both spatial distance and envi-ronmental factors.

butyrate degradation; methanogenic production; relative abundance of; microbial biogeography

10.13209/j.0479-8023.2020.109

2019?12?23;

2020?04?25

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0200306)和國家自然科學基金(41630857)資助