李敏杰，熊亞

1. 攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院（攀枝花 617000）；2. 攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心（攀枝花 617000）

蜂蜜酒是以蜂蜜為原料，經(jīng)過(guò)稀釋、調(diào)整、發(fā)酵、澄清、過(guò)濾、陳釀后所獲得的低度酒精飲料[1]。蜂蜜的主要成分是葡萄糖、果糖及其他高級(jí)營(yíng)養(yǎng)成分，因此以蜂蜜為原料釀造的蜜酒對(duì)人體具有很強(qiáng)的保健作用[2]。蜂蜜酒中含有多種維生素、礦物質(zhì)和人體必需的18種氨基酸等，對(duì)治療失眠、健忘、精神不振、性功能衰退等有良好的輔助作用，對(duì)胃腸慢性病、慢性支氣管炎、哮喘等痼疾有良好作用[3]。此次試驗(yàn)選取產(chǎn)自攀枝花老鹽邊大山深處的土蜂蜜，相比傳統(tǒng)農(nóng)家蜂蜜以及意蜂蜜而言，土蜂蜜在美容、減肥、養(yǎng)生方面效果更好。

近年來(lái)，以蜂蜜為原料生產(chǎn)的蜂蜜酒，其保健功能集蜂產(chǎn)品和發(fā)酵產(chǎn)品為一身，以保健酒為基礎(chǔ)的蜂蜜酒開(kāi)發(fā)更具特色[4]，對(duì)蜂蜜酒的釀制已經(jīng)不僅僅局限于純蜂蜜釀酒，更多的蜂蜜保健酒開(kāi)始出現(xiàn)在市場(chǎng)、民間作坊中，如綠茶蜂蜜酒[5]、紅曲蜂蜜酒[6]、發(fā)酵型五味子蜂蜜果酒[7]、紅棗蜂蜜保健酒[8]等。對(duì)各種類(lèi)型蜂蜜酒的研制更加注重發(fā)酵工藝的優(yōu)化，章芒芒等[9]采用正交設(shè)計(jì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，對(duì)蜂蜜酒主發(fā)酵的最佳條件進(jìn)行了研究，得出溫度、尿素添加量、磷酸銨比例、pH及酵母接種量、發(fā)酵周期的最佳值；王淼[10]則從發(fā)酵溫度、總酸度、溶解氧及菌數(shù)控制等方面對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行了最優(yōu)化組合；陶樹(shù)興等[11]通過(guò)蜂蜜酒發(fā)酵及雜醇油含量的變化，探討了氮源種類(lèi)和濃度對(duì)它們的影響，為蜂蜜酒的釀造提供了一定的參考。目前，利用響應(yīng)面法對(duì)蜂蜜酒發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報(bào)道還很少。此次試驗(yàn)以攀枝花土蜂蜜為原料，以土蜂蜜酒發(fā)酵產(chǎn)酒精度為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對(duì)土蜂蜜酒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為攀枝花土蜂蜜的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的參考價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

攀枝花土蜂蜜（攀枝花市售）；酵母（安琪高活性酵母，湖北宜昌安琪酵母股份有限公司）；亞硫酸（99.8%，成都科龍化工試劑廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

土蜂蜜→稀釋→滅菌鍋殺菌30 min→冷卻到25～30 ℃→加酵母（活化35 min）→主發(fā)酵→澄清→陳釀后發(fā)酵→過(guò)濾→調(diào)配

稱(chēng)取300 g的土蜂蜜，加1 L的蒸餾水稀釋?zhuān)?10 ℃滅菌30 min。冷卻后裝入發(fā)酵罐，加入活化后的酵母，調(diào)節(jié)pH，放入恒溫箱進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，倒罐、過(guò)濾[12]，低溫下進(jìn)行陳釀，檢測(cè)酒精度。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

選用pH、溫度、酵母菌添加量及通氣量4個(gè)因素，按照不同的pH（3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和5.5）、溫度（15，20，25，30和35 ℃）、酵母菌添加量（1%，2%，3%，4%，5%和6%）、通氣量（0，1，2，3和4次/d）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，檢測(cè)土蜂蜜酒發(fā)酵的酒精度。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用SAS 9.2軟件中Box- Behnken設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析和數(shù)據(jù)處理，以pH（X1）、溫度（X2）、酵母菌添加量（X3）及通氣量（X4）為自變量，以酒精度（Y）為響應(yīng)值，確定各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，得到土蜂蜜酒發(fā)酵的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

由圖1可知，當(dāng)pH為4.5時(shí)，土蜂蜜酒的酒精度達(dá)到最高，為9.6%vol。酵母菌的生長(zhǎng)對(duì)pH比較敏感，pH過(guò)低或pH過(guò)高均會(huì)抑制其生長(zhǎng)，從而影響酒精的生成。

圖1 pH對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

由圖2可知，當(dāng)溫度升高時(shí)，酒精度也上升，這是由于酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝活動(dòng)受溫度影響比較大。酵母菌的一切生理活動(dòng)與酶的活力相關(guān)，而酶活力要在最佳溫度范圍內(nèi)才得以發(fā)揮。當(dāng)溫度超過(guò)25 ℃時(shí)，酵母菌離開(kāi)了最適溫度范圍，生長(zhǎng)代謝變慢，所以酒精度也開(kāi)始下降。因此選擇發(fā)酵溫度25 ℃。

2.1.3 酵母添加量對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

由圖3可知，增加酵母添加量可以使生成的酒精度增加，這是由于足夠的酵母菌添加比例，可以快速地使酵母菌在發(fā)酵醪液中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，抑制雜菌的生長(zhǎng)，從而使酒精生成量增加。而當(dāng)酵母菌濃度超過(guò)4%時(shí)，由于發(fā)酵醪液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，酵母菌的生長(zhǎng)在后期會(huì)放緩，造成早衰，使酒精生成量下降。所以酵母菌接種量在4%時(shí)最適宜。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

圖3 酵母菌添加量對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

2.1.4 通氣量對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

酵母菌的生長(zhǎng)繁殖需要氧參與，所以提供必要的通氣量對(duì)酒精度的生成有益。但是由于酒精生成是厭氧過(guò)程，過(guò)多的通氧會(huì)導(dǎo)致葡萄糖完全氧化為二氧化碳、水和能量，減少酒精的生成。由圖4中可知，當(dāng)通氣量為1次/d時(shí)，酒精生成量達(dá)到最大。

圖4 通氣量對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 選取響應(yīng)面分析的因素及水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析，其因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

對(duì)pH（A）、發(fā)酵溫度（B）、酵母添加量（C）及通氣量（D）作如下變換：X1=（A-4.5）/0.5，X2=（B-25）/5，X3=（C-4）/2，X4=（D-1）/1。以X1、X2、X3、X4為自變量，酒精度為響應(yīng)值（Y），方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果

從表3可知，模型的p=0.000 1＜0.01，表明模型方程極顯著。失擬項(xiàng)p值=0.065 4＞0.05，說(shuō)明方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度良好，此方法可靠。X2、X3、X4對(duì)Y有顯著性影響，X2、X4為正效應(yīng)，X3為負(fù)效應(yīng)，X2影響極顯著；二次項(xiàng)X22、X32對(duì)Y也有顯著影響，均為負(fù)效應(yīng)，X32影響極顯著。其余變量的影響均不顯著（p＞0.05）。結(jié)合表3各項(xiàng)數(shù)值可以分析出，各因素對(duì)土蜂蜜酒酒精度的影響程度依次為溫度、酵母菌添加量、通氣量、pH。

2.2.3 土蜂蜜酒發(fā)酵條件優(yōu)化的響應(yīng)面及等高線圖

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y酒精度對(duì)各試驗(yàn)因子X(jué)1、X2、X3、X4的函數(shù)圖形，可以選擇出試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的最優(yōu)化條件，從響應(yīng)面圖形上可以得出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[13]，響應(yīng)面分析等高圖直觀地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[14]。土蜂蜜酒發(fā)酵條件響應(yīng)面分析及等高線圖見(jiàn)圖5～圖10。

分別對(duì)二次回歸方程的X1、X2、X3、X4求一階偏導(dǎo)，求解，得：X1=-0.279 6，X2=1.367 1，X3=-0.203 3，X4=0.621 8。代入變換公式X1=（A-4.5）/0.5，X2=（B-25）/5，X3=（C-4）/2，X4=（D-1）/1?？傻胮H為4.36，發(fā)酵溫度為31.8 ℃，酵母菌添加量為3.59%，通氣量最多為2次/d。在此條件下，蜂蜜酒發(fā)酵酒精度的理論值為11.6%vol。

表3 回歸分析結(jié)果

圖5 Y=f (X1, X2)的響應(yīng)面及等高線圖

圖6 Y=f (X1, X3)的響應(yīng)面及等高線圖

圖7 Y=f (X1, X4)的響應(yīng)面及等高線圖

圖8 Y=f (X2, X3)的響應(yīng)面及等高線圖

圖9 Y=f (X2, X4)的響應(yīng)面及等高線圖

圖10 Y=f (X3, X4）的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在上述最佳發(fā)酵條件下重復(fù)土蜂蜜酒發(fā)酵3次，測(cè)得的平均酒精度為11.1%vol，與模型預(yù)測(cè)值11.6%相接近，可見(jiàn)模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際土蜂蜜酒發(fā)酵酒精度的情況，所以基于響應(yīng)面優(yōu)化的土蜂蜜酒發(fā)酵條件參數(shù)比較可靠。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面優(yōu)化土蜂蜜酒發(fā)酵條件得到的酒精度的回歸方法，通過(guò)方差分析，證明方程對(duì)試驗(yàn)的擬合度良好。對(duì)土蜂蜜酒酒精度影響因素的排名依次為溫度、酵母菌添加量、通氣量、pH。土蜂蜜酒發(fā)酵最佳參數(shù)為pH 4.36、發(fā)酵溫度31.8 ℃、酵母菌添加量3.59%、通氣量2次/d。在此條件下，土蜂蜜酒發(fā)酵產(chǎn)酒精度的理論值為11.6%vol，與驗(yàn)證試驗(yàn)11.1%vol比較接近。此款土蜂蜜酒顏色金黃，有蜂蜜的清香，酒香濃郁，口味獨(dú)特，為攀枝花土蜂蜜的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定的參考價(jià)值。