陳 雷申琳溪馬翠紅王光玉

(哈爾濱工業(yè)大學(威海)海洋科學與技術學院 生物工程系,山東 威海264209)

植物內生菌是指在植物的部分或全部生活史中,生長在植物細胞間或細胞內,且不會對植物造成直接或明顯負面影響的一類微生物,包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌[1]。放線菌是一類革蘭氏陽性菌,相比于其他內生菌群,內生放線菌有著其獨特的代謝產物,是新型生物活性化合物的重要來源[2]。研究表明,內生菌普遍存在于各種陸生及水生植物中,而最早發(fā)現(xiàn)的內生放線菌是與非豆科植物共生固氮的弗蘭克氏屬(Frankia)放線菌[3-4]。2003年Strobel和Daisy[5]曾指出,用于分離內生菌的植物宿主要有選擇性,應選擇有重要植物學價值、處于不常見環(huán)境、有特殊生物學意義等的植物。目前對于植物內生放線菌的研究,以紅樹林、熱帶常綠灌木林及一些藥用植物研究居多。

大葉藻(Zostera marina)是一種水生單子葉植物,是最常見的海草床種類之一,在太平洋和大西洋沿海均有廣泛分布[6]。我國的大葉藻主要分布于遼寧、河北和山東等沿海水域[7]。目前對于大葉藻的研究主要集中在其生態(tài)作用和生態(tài)修復等方面。相較于其他陸生高等植物,大葉藻因生長于海中,生長代謝機制獨特,其體內可能蘊藏著獨特的共生微生物資源,目前有關這方面的研究報道較少。研究表明,自然環(huán)境中可在實驗室條件下被分離培養(yǎng)的稀有放線菌較少,所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等都不同[8-9]。本研究通過純培養(yǎng)法,使用多種培養(yǎng)基對榮成天鵝湖濕地大葉藻的內生放線菌進行分離,以期獲得較多的菌株,豐富濱海植物內生菌資源,為內生放線菌資源的利用和天然產物的開發(fā)提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大葉藻樣品

大葉藻(Zostera marina)樣品采自山東省威海市榮成天鵝湖濕地(122°33′E,37°20′N)。將采集到的樣品進行表面清潔后裝入無菌封口袋中,并放在冷藏箱內(4℃)帶回實驗室用于分離試驗。

1.1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基:采用2216E[10],HV[11],SCA[12],M2[13],ISP2[14],R2A[15]和RO七種培養(yǎng)基[16]。為抑制細菌和真菌的生長,本試驗需在培養(yǎng)基滅菌后加入抗生素(放線菌酮的終濃度為100 mg/m L,萘啶酸的終濃度為20 mg/m L),用0.22μm的濾膜過濾備用。

M1固體及液體培養(yǎng)基[10]用于待測菌的純化、培養(yǎng)與保藏。Mueller-Hinton肉湯(Mueller-Hinton Broth,MHB)和Mueller-Hinton瓊脂(Mueller-Hinton Agar,MHA)均購于青島海博生物技術有限公司,用于指示菌的培養(yǎng)與抗菌活性篩選。

1.1.3 指示菌

本試驗采用的指示菌包括:大腸埃希氏菌(Escherichia coli,簡稱Ec)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,簡稱Sa)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis,簡稱Bs)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,簡稱Pa)和白假絲酵母(Candida albicans,簡稱Ca),5種均來自中國科學院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心;副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,簡稱Vp)來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鰻弧菌(Vibrio anguillarum,簡稱Va)由中國科學院海洋研究所的鄒玉霞副研究員提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 大葉藻內生放線菌的分離

將采集到的大葉藻樣品置于超凈工作臺中,為避免大葉藻表面附著的微生物和其他雜質對試驗的干擾,需要對采集到的大葉藻樣品進行表面消毒:首先,在超凈工作臺中將大葉藻樣品用無菌海水沖洗3～5次;然后,將大葉藻置于滅過菌的平皿中,用次氯酸鈉溶液(有效氯5%)浸泡5 min,用無菌水清洗3次;用乙醇(V乙醇∶VH2O=3∶1)浸泡3 min[17],再用無菌水清洗3次,使用無菌濾紙吸干大葉藻樣品表面的水分;最后,取最后一遍清洗的無菌水100μL涂布于2216E培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)14～21 d后如果無菌落長出,表明大葉藻葉片的表面消毒較徹底[18]。

用無菌的鑷子和剪刀將樣品剪成約2 mm×2 mm的小塊,在滅過菌的研缽中研磨成勻漿用于分離試驗。首先,將大葉藻勻漿置于55℃水浴鍋中加熱6 min,取0.5 m L勻漿加入到含有4.5 m L無菌海水的試管中,振蕩混勻;然后,進行梯度稀釋,用移液器從1∶1000、1∶10000和1∶100000的試管中分別取100 μL的溶液均勻涂布于7種固體分離培養(yǎng)基上,每種濃度在每種培養(yǎng)基上做3個平行;最后,放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～30 d。

用接種環(huán)挑取形態(tài)不同的菌落進行多次平板劃線純化,同時進行菌落數(shù)量和種類的記錄,將純化后的放線菌保存到M1固體培養(yǎng)基斜面上,置于4℃冰箱保藏。同時用質量分數(shù)15%的甘油進行菌種保藏,置于-80℃冰箱中。

1.2.2 抗菌活性篩選

采用紙片法[19-20],通過觀察待測放線菌的發(fā)酵產物粗提物對7種指示菌生長的抑制來篩選抗菌活性。用接種環(huán)將待測菌株接種于50 m L M1液體培養(yǎng)基中,在150 r/min,28℃的搖床條件下培養(yǎng)7～10 d。發(fā)酵結束后,在發(fā)酵液中加入等量的乙酸乙酯萃取3次。將有機相合并后,在旋轉蒸發(fā)儀中減壓蒸干,用DMSO溶解粗提物,配成25 mg/m L的溶液,置于4℃冰箱中保存,用于抗菌活性檢測。

將7種指示菌分別接種于MHB培養(yǎng)基中,28℃搖床中培養(yǎng)過夜。在直徑為6 mm的濾紙片上滴10μL粗提物溶液。將適量的指示菌在二次傳代培養(yǎng)后24 h內,用生理鹽水配制成麥氏濁度為0.5的菌懸液,并將該菌懸液各100μL涂布于MHA培養(yǎng)基平板上,放置3～5 min,讓表面多余的水分被瓊脂吸收,然后將濾紙片放在平板上。用等量的二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)作為陰性對照;用氯霉素(30μg)、慶大霉素(10μg)和制霉菌素(10μg)作為陽性對照,所有試驗需重復3次。然后將抗菌活性測試平板放在指示菌適宜的溫度下培養(yǎng)1～2 d。通過測定在紙片周圍產生的抑菌圈的直徑來反映其抗菌活性。

2 結果與分析

2.1 大葉藻內生放線菌的分離結果

從大葉藻中共分離出內生放線菌62株。根據(jù)菌株在培養(yǎng)基上的菌落特征,比較了不同培養(yǎng)基的放線菌分離效果,結果見表1。其中,RO培養(yǎng)基分離出的放線菌的種類和數(shù)量最多,其次是ISP2培養(yǎng)基,M2培養(yǎng)基分離出的放線菌的種類和數(shù)量都是最少的。

表1 大葉藻內生放線菌在7種培養(yǎng)基上的分離效果Table 1 Isolation result of endophytic actinomycetes associated with Zostera marina on seven kinds of media

2.2 抗菌活性篩選結果

本試驗采用紙片法,選取了7株指示菌,對62株大葉藻內生放線菌的抗菌活性進行篩選。由圖1可見,大葉藻內生放線菌對每種指示菌有抑制作用的菌株數(shù)?？咕囼灲Y果如表2和圖1所示,其中有48株放線菌至少對1種指示菌有抑制作用,占待測菌株的77.42%;有36株放線菌同時對2種及2種以上的指示菌有抑制作用,占待測菌株的58.06%;有16株放線菌同時對3種及3種以上指示菌有抑制作用,占待測菌株的25.80%;DYZ047同時對6種指示菌有抑制作用,其中DYZ047對大腸埃希氏菌E.coli、銅綠假單胞菌P.aeruginosa和副溶血性弧菌V.parahemolyticus的抗菌結果如圖2所示。結果表明,大葉藻內生放線菌對多種指示菌都顯示出抗性。

圖1 大葉藻內生放線菌抑制指示菌的菌株數(shù)Fig.1 Number of endophytic actinomycetes inhibiting indicator strains

列Va +只----+---++++++++-++--------++--++中表Vp++++++++mm。-------++++++++-++----------d≥12表Ca +---++++-------------------+”代++Pa -+--++++++--+++++++-----------marina＜12mm,“++++++Bs +++++++++++++++++++++++++++++-+-++++++++++-++++-10≤d表Sa ++++++++++++++++-+++++++++++++++”代++++++-+++++++++++++++++++++++++++++性Ec ++mm,“++--++++---++--------------活++菌++抗的號8≤d＜10表菌株線DYZ038 DYZ039 DYZ040 DYZ041 DYZ042 DYZ043 DYZ044 DYZ045 DYZ046 DYZ047 DYZ048 DYZ049 DYZ050 DYZ051 DYZ052 DYZ053 DYZ054 DYZ055 DYZ056 DYZ057 DYZ059 DYZ060 DYZ061 DYZ062放+”代Va菌-藻生----內------------------++++2葉++Table2 Antimicrobialactivityofendophytic actinomycetesassociatedwith Zostera大6＜d＜8mm,“+表Vp +++++--++---+++++-++----++---++表Ca +,“+”代------++-----------------示表d用Pa 徑-----------------------++直圈菌抑Bs ++。------++-+---++----++++++--+++制抑有表Sa ++++++++++++++++++++++++++++++++-++++++++++++++++++++++++;“+”代據(jù)數(shù)的制株Ec抑-----------------+------有沒菌性活表菌號抗株DYZ001 DYZ002 DYZ004 DYZ005 DYZ009 DYZ011 DYZ013 DYZ015 DYZ017 DYZ019 DYZ022 DYZ023 DYZ024 DYZ027 DYZ028 DYZ029 DYZ030 DYZ031 DYZ032 DYZ033 DYZ034 DYZ035 DYZ036 DYZ037:“-”代有菌注具了出

圖2 菌株DYZ047的抗菌活性結果Fig.2 Antimicrobial activities of the isolated strain DYZ047

大葉藻內生放線菌對革蘭氏陽性指示菌的抗菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性指示菌。對金黃色葡萄球菌S.aureus有抑制作用的放線菌有45株,占放線菌總數(shù)的72.58%;12株菌的抑制作用較強,抑制圈直徑在12.0 mm以上,其中DYZ019的抑菌圈直徑最大達到15.8 mm。對枯草芽孢桿菌B.subtilis有抑制作用的放線菌有28株,占放線菌總數(shù)的45.16%;3株菌的抑制作用很強,抑制圈直徑超過12.0 mm,其中DYZ047抑制作用最強,抑菌圈達到20.7 mm。

大葉藻內生放線菌對革蘭氏陰性指示菌和真菌的抗菌活性菌株相對較少。對白假絲酵母C.albicans有抑制作用的放線菌有3株,占放線菌總數(shù)的4.84%。對大腸埃希氏菌E.coli有抑制作用的放線菌有6株,占放線菌總數(shù)的9.68%。對銅綠假單胞菌P.aeruginosa有抑制作用的有9株,占放線菌總數(shù)的14.52%。對鰻弧菌V.anguillarum有抑制作用的放線菌有7株,占放線菌總數(shù)的11.29%。其中,有3株菌(DYZ013,DYZ047和DYZ049)的抑制作用較強,抑制圈直徑在12.0 mm以上,DYZ047抑制作用最強,抑菌圈達到20.1 mm。對副溶血性弧菌V.parahemolyticus有抑制作用的放線菌有17株,占放線菌總數(shù)的27.42%;其中,有3株菌(DYZ037,DYZ046和DYZ047)的抑制作用較強,抑制圈直徑在12.0 mm以上,DYZ047的抑菌圈直徑為18.0 mm,DYZ037的抑菌圈最大為18.6 mm。

3 討 論

在純培養(yǎng)法中培養(yǎng)基的選擇對放線菌的分離結果有很大影響,放線菌適合在干燥、堿性的條件下生長[21]。RO培養(yǎng)基中微量元素豐富,有利于放線菌的生長,取得較好的分離效果。ISP2培養(yǎng)基含有放線菌偏愛的糖成分(麥芽糖),分離到的大葉藻內生放線菌總數(shù)和種類數(shù)也較好。由于實驗室培養(yǎng)放線菌時無法完全模擬自然環(huán)境,放線菌可能會迫于環(huán)境壓力發(fā)生生理上的變化,處于休眠狀態(tài),稱為活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable But Non-Culturable State,VBNC),采用常規(guī)的培養(yǎng)方法無法使其恢復生長活性[22]。由于分離條件等的限制,目前得到的大葉藻中內生放線菌的種類和數(shù)量可能還遠遠不夠,以后可以進一步通過與免培養(yǎng)相結合的方法研究其多樣性[23]。

本試驗所選用的兩株革蘭氏陽性指示菌,分別為金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌。分離出的大葉藻內生放線菌對這兩株革蘭氏陽性指示菌的抑制作用較強。李靜等[24]對從海南東寨港真紅樹植物中分離到46株內生放線菌,使用乙酸乙酯提取發(fā)酵液進行抗菌活性篩選,結果發(fā)現(xiàn)40株菌對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出較好的抑制作用。林嬋春等[25]對分離自川芎的30株內生放線菌進行抗菌活性篩選,對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抑制活性的有25株菌,占其待測總數(shù)的83.33%,對枯草芽孢桿菌表現(xiàn)出抑制活性的有23株,占其待測總數(shù)的76.67%。本試驗中大葉藻內生放線菌對革蘭氏陰性指示菌的抑制作用較弱。這可能是由于革蘭氏陰性細菌具有外膜屏障和多藥外排泵,通常比革蘭氏陽性細菌更耐抗生素[26]。革蘭氏陰性細菌的外膜對大的帶電分子不滲透,限制了各種抗生素類藥物進入細胞內[27]。多藥外排泵是膜定位的轉運蛋白,能夠將多種化合物(包括藥物分子)轉運出細胞,從而阻止藥物進入靶細胞[28]。

4 結 語

本研究采用純培養(yǎng)方法從山東省威海市的榮成天鵝湖采集的大葉藻中分離內生放線菌,并對放線菌的抗菌活性進行篩選。結果表明,從大葉藻中共分離到內生放線菌62株,內生放線菌資源較為豐富;對多種指示菌都表現(xiàn)出較好的抗性,有48株放線菌(占77.42%)至少對1種指示菌表現(xiàn)出一定的抑制作用,有36株放線菌(占58.06%)抑制2種及2種以上指示菌,發(fā)現(xiàn)了一批具有較好抗菌活性的菌株,DYZ047同時對6株指示菌有抑制作用;對革蘭氏陽性指示菌的抗菌效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性指示菌,有45株放線菌(占72.58%)對金黃色葡萄球菌有抑制作用,有28株放線菌(45.16%)對枯草芽孢桿菌有抑制作用。后期可以繼續(xù)進行抗菌活性化合物的分離,為海洋來源抗生素的研究提供新資源。