李 麗 張 靜 郭錦濤

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，是威脅人類生命健康的重大殺手[1]。在所有預(yù)測的惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中，胃癌位居第三位，約占10%[2-3]。胃癌的快速增殖與凋亡失衡是胃癌患者死亡的主要原因，為改善胃癌預(yù)后結(jié)局計，需要進行早期診斷與根治[4]。胃癌的確切病因尚未完全闡明，目前認為是幽門螺旋桿菌感染、環(huán)境因素和遺傳因素協(xié)同作用的結(jié)果[5-6]。磷酸酶和張力蛋白同源物(Phosphatase and tensin homologue-deleted chromosome ten gene，PTEN)為編碼403個氨基酸的產(chǎn)物，位于10q23.3具有雙重磷酸酶活性的蛋白，其可拮抗PI3激酶(PI3K)活性，從而促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲活性的增加[7-8]。microRNA是非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，可參與細胞分化、凋亡、生長等過程，其異常表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[9]。miR-106a是參與細胞的增殖、凋亡和變異等過程的microRNA[10-11]。本文具體探討了miR-106a調(diào)控JSTAT3信號通路對胃癌細胞增殖與遷移的影響，希望有助于揭示miR-106a在胃癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

胃癌BGC-823細胞株(購自中國科學(xué)院細胞庫)，鼠抗人PTEN單克隆抗體(R&D，USA)，山羊抗小鼠β-actin(Santa Cruz公司)，miR-106a引物、β-Actin引物(上海生工生物工程有限公司)，qPCR檢測試劑盒(Takara公司)，miR-106a NC、miR-106a mimics、轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Sigma公司)，胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

BGC-823細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPIM-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的U87MG細胞按5×105個/ml的密度接種于培養(yǎng)皿中并分為三組：miR-106a組、對照組與空白組，分別轉(zhuǎn)染200 ng/ml miR-106a mimic、200 ng/ml miR-NC與等體系的磷酸鹽緩沖液，轉(zhuǎn)染后6 h后進行換液培養(yǎng)。

1.3 CCK法檢測細胞增殖

制成單細胞懸液(5×105個/ml)，鋪板96孔板，每孔加入200 μl細胞懸液，然后采用CCK-8細胞增殖與活性檢測試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測細胞增殖情況，具體步驟參照試劑盒說明書，最后在490 nm處采用酶標儀中測定吸光值，讀取與計算細胞增殖指數(shù)。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，棄上清，重懸后收集細胞，采用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測細胞凋亡，按照試劑盒說明書進行反應(yīng)后，30 min內(nèi)進行流式細胞儀檢測，并計算細胞凋亡指數(shù)。

1.5 Transwell小室實驗檢測細胞遷移與侵襲

調(diào)整濃度為2×105個/ml，在下室加入培養(yǎng)基(含10% FBS)，上室加入細胞懸液，培養(yǎng)24 h；取出上室，采用多聚甲醛室溫固定30 min，然后采用0.4%結(jié)晶紫室溫染色15～30 min，中性樹膠封片，鏡下觀察并計算細胞遷移指數(shù)。在檢測細胞侵襲中，以2×105個細胞密度接種于24孔板的Transwell小室中，向Transwell小室下加入500 μl的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，固定后也進行結(jié)晶紫室溫染色15～30 min，中性樹膠封片，鏡下觀察并計算細胞侵襲指數(shù)。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

全蛋白提取試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量檢測試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)進行蛋白定量，上樣SDS-PAGE膠，轉(zhuǎn)膜后進行Western blot檢測(β-Actin抗體、PTEN抗體)，圖像分析軟件分析目的蛋白條帶灰度，記錄其相對表達量。

1.7 qRT-PCR檢測基因表達

細胞轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，RNA提取試劑盒(購自碧云天生物技術(shù)有限公司)提取細胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以器為模板，進行qRT-PCR檢測目的基因表達。miR-106a引物：上游：5-'GCCAACGTCAGTAGGCAGA-3'，下游：5-'GCCAACCATGATCTGCTGAAAC-3'。

1.8 統(tǒng)計方法

SPSS 22.0分析所得數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差進行表示，采用t檢驗和采用單因素方差分析進行組間的數(shù)據(jù)對比，以ɑ=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 miR-106a表達對比

細胞轉(zhuǎn)染24 h與48 h后，miR-106a組的miR-106a相對表達量顯著高于空白組和對照組(P<0.05)，而后兩組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與24 h時相比，48 h時miR-106a組細胞miR-106a相對表達量顯著增高(P<0.05)，另外兩組兩個時間點相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組miR-106a相對表達量對比

2.2 細胞增殖指數(shù)對比

細胞轉(zhuǎn)染24 h與48 h后，miR-106a組的細胞增殖指數(shù)較空白組和對照組顯著降低(P<0.05)，而后兩組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與24 h時相比，48 h時miR-106a組細胞增殖指數(shù)顯著增加(P<0.05)，另外兩組兩個時間點相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組細胞增殖指數(shù)對比

2.3 細胞凋亡情況對比

細胞轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組細胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05)。與24 h時相比，48 h時三組細胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05)，見表3。

表3 三組細胞凋亡指數(shù)對比

2.4 細胞遷移與侵襲指數(shù)對比

細胞轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組細胞遷移與侵襲指數(shù)顯著降低(P<0.05)。與24 h時相比，48 h時三組細胞遷移與侵襲指數(shù)顯著增加(P<0.05)，見表4。

表4 三組細胞遷移與侵襲指數(shù)對比

2.5 PTEN蛋白表達對比

轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，miR-106a組PTEN蛋白相對表達水平均顯著低于空白組和對照組(P<0.05)。與24 h時相比，48 h時三組細胞PTEN蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)，見表5。

表5 三組細胞PTEN蛋白相對表達水平對比

3 討論

胃癌是威脅人類生命健康的重大殺手。早期胃癌的5年生存率在90%以上，而晚期胃癌的生存率低于10%[12]。腫瘤增殖和凋亡是極其復(fù)雜的發(fā)展過程，對其進行早期干預(yù)能顯著性地提高患者生存率[13]。miRNA是一類高度保守的非編碼RNA，參與細胞生長、增殖、發(fā)育、分化、凋亡、遷移等生命活動[14]。miR-106a是miR家族中重要的一員，是與人類腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一，調(diào)控細胞的增殖、分化、形成抗藥性以及編碼炎性蛋白、造血和紅細胞生成、腫瘤抑制基因等過程[15-17]。本研究顯示細胞轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組的細胞增殖指數(shù)顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡指數(shù)顯著增加(P<0.05)，表明miR-106a的過表達能抑制胃癌細胞增殖，促進細胞凋亡。

相關(guān)研究表明：miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制靶基因mRNA翻譯或誘導(dǎo)靶基因mRNA降解來調(diào)控靶基因的表達，從而參與早期胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展、細胞增殖和凋亡等過程[18]。本研究顯示細胞轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，與空白組和對照組相比，miR-106a組的細胞遷移與侵襲指數(shù)顯著降低(P<0.05)，表明miR-106a的過表達能抑制胃癌細胞轉(zhuǎn)移與侵襲。

胃癌的發(fā)生包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活，一旦它們表達失調(diào)，則有可能快速地促進腫瘤的形成。miRNA可通過靶向于不同的促癌或者抑癌基因而在胃癌形成中產(chǎn)生類似腫瘤抑制因子或者促癌因子的作用[19-20]。PTEN參與調(diào)節(jié)腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，從而發(fā)揮抑癌基因作用。有研究表明PTEN或其蛋白的丟失與惡性腫瘤的進展顯著相關(guān)，胃癌組織PTEN蛋白表達陽性率高于相鄰正常組織，從而發(fā)揮促癌基因作用[21-22]。miRNA是通過抑制靶基因PTEN的表達而發(fā)揮作用，其可與PTEN mRNA的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄翻譯，從而參與調(diào)控單核細胞凋亡延遲[23-24]。本研究顯示細胞轉(zhuǎn)染后24 h與48 h，miR-106a組的PTEN蛋白相對表達水平較空白組和對照組顯著降低(P<0.05)，而后兩者相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明miR-106a的過表達能靶向抑制PTEN信號通路的激活。

本研究不足之處在于--僅初步闡述了miR-106a與PTEN在胃癌細胞中關(guān)系，其對于胃癌的調(diào)控作用仍需要進一步的實驗研究來完善。綜上所述，miR-106a的過表達可靶向抑制PTEN信號通路的激活，從而抑制胃癌細胞增殖、遷移與侵襲，促進細胞凋亡。