楊紅紅 左汶奇 羅小莉 鐘時勛

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，耳鼻咽喉科（重慶 400016）

手機(jī)產(chǎn)生的電磁輻射（electromagnetic radiation，EMR）已成為影響人們生活健康的一個重要污染源。聯(lián)合國人類環(huán)境會議已將EMR列為必須控制的公害之一[1]。關(guān)于手機(jī)對人體的影響，目前有學(xué)者發(fā)現(xiàn)長期使用手機(jī)會降低精子活力影響生育[2,3]，增加聽神經(jīng)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)[4]，還有大量流行病學(xué)研究表明，長期使用手機(jī)人群常常有頭痛、睡眠障礙、疲勞、認(rèn)知障礙、記憶力下降、頭暈和抑郁等不良反應(yīng)[5,6]。

手機(jī)EMR對人體的影響是目前研究的熱點(diǎn)，衡量EMR強(qiáng)度的常用指標(biāo)有頻率和比吸收率（Specific absorption rate，SAR）。1800MHz（4G）是目前全球移動通信系統(tǒng)常用的頻率，而3500MHz是5G移動通訊的頻率，即將廣泛應(yīng)用。SAR指單位時間內(nèi)單位質(zhì)量物質(zhì)吸收的EMR能量，其單位是w/kg，通常被用來衡量手機(jī)電磁輻射的強(qiáng)弱。美國、歐洲和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)SAR值通常設(shè)置上線為2w/kg，但部分職業(yè)暴露時可達(dá)到10w/kg[7]。

雙耳和大腦是手機(jī)EMR的直接效應(yīng)器官，也是暴露時間最長的器官，但關(guān)于手機(jī)EMR對聽覺器官影響的研究目前仍存在爭議。聽皮層是感知外界信號的高級神經(jīng)中樞，在信號處理加工過程中起著重要作用[8]。EMR對聽覺系統(tǒng)的研究多集中于耳蝸，如導(dǎo)致耳蝸邊緣細(xì)胞活性氧生成增加[9]，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞自噬小體生成[10]，支持細(xì)胞及毛細(xì)胞的凋亡和壞死[11]，但對聽皮層的影響研究較少。曠場實(shí)驗(yàn)是用于評價(jià)動物在新異環(huán)境中自主行為、探索行為與緊張度的一種方法，是檢測動物焦慮行為的一種常見的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法[12]。因此，本課題組擬在動物模型的基礎(chǔ)上，探討3500MHz（5G）輻射頻率，SAR在2w/kg、4w/kg和10w/kg模式下，觀察輻射前后聽力閾值和曠場行為指標(biāo)變化，聽皮層氧化應(yīng)激產(chǎn)物濃度（MDA含量）及抗氧化酶活性（SOD、GSH-px活力），以及細(xì)胞凋亡因子細(xì)胞色素C（Cytochrome c,Cyt c）和Caspase-9的表達(dá)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取耳廓反應(yīng)靈敏、ABR檢測聽閾不超過30dB、無中耳疾病的健康白化紅目豚鼠28只，雄性，體重300-350g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將篩選后的28只豚鼠隨機(jī)分為4組（n=7）：假輻射組(Sham)及輻射組（2w/kg、4w/kg、10w/kg）。Sham 組置于輻射箱中不開輻射源，輻射組分別置于SAR：2w/kg,4w/kg,10w/kg連續(xù)暴露72小時。實(shí)驗(yàn)過程中不限制豚鼠自由活動、進(jìn)食及飲水，實(shí)驗(yàn)中所有動物均按照標(biāo)準(zhǔn)化流程飼養(yǎng)，并得到重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 試劑

丙二醛(MDA)試劑盒(批號 20190703)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：20190701)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號：20190702)均由南京建成生物工程研究所提供，BCA蛋白定量檢測試劑盒（批號：20190724），細(xì)胞色素C抗體（貨號：GB11080），Caspase-9抗體（貨號：AB52298）均由武漢賽維爾生物科技有限公司提供。

1.3 3500MHZ輻射系統(tǒng)的建立

輻射系統(tǒng)建立參照文獻(xiàn)[13],該系統(tǒng)由六部分組成：輻射源（National Instrument,USRP-2900，美國），功率放大器（恒智微波，中國），喇叭天線（A-INFO，中國），自制鐵皮動物輻射箱（長寬高為60、60、80厘米），內(nèi)置木箱（長寬高為40、40、60厘米），計(jì)算機(jī)。暴露程序采用軟件控制，輻射強(qiáng)度及頻率穩(wěn)定且符合實(shí)驗(yàn)要求。

1.4 實(shí)驗(yàn)動物的聽性腦干反應(yīng)（ABR）測定

造模前及造模完成取材前均行豚鼠雙耳ABR閾值測試，測試儀器為誘發(fā)電位儀（INTELLEGENT HEARING，美國），測試軟件為SMART EP，測試在電聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。豚鼠經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40mg/Kg）麻醉后，記錄電極置于顱頂，參考電極置于測試耳耳廓后，地極置于對側(cè)耳耳廓后，單頻單耳刺激給聲，刺激聲為短音，極性為交替波。檢測從80dB開始，每20dB一檔逐漸遞減，接近閾值時，每10dB、5dB遞減，引出反應(yīng)閾。閾值的判定標(biāo)準(zhǔn)為能獲得可重復(fù)Ⅲ波的最小聲強(qiáng)度。

1.5 曠場實(shí)驗(yàn)檢測

在造模完成時，ABR檢測前行曠場實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[14],實(shí)驗(yàn)裝置為一個四周及底壁均為黑色的有機(jī)塑料盒子（100×100×50cm），底壁等分為9個方格。實(shí)驗(yàn)在安靜、昏暗燈光下的房間內(nèi)進(jìn)行，使用動物行為自動跟蹤系統(tǒng)（ZH曠場實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)，中國）記錄并分析豚鼠在曠場內(nèi)15分鐘的總行程、中央格停留時間、平均速度。檢查時每只豚鼠置于中央格內(nèi)。為了消除異味，在每次測試之間用70%酒精徹底清潔消毒。

1.6 聽皮層MDA及SOD、GSH-px檢測

每組隨機(jī)取4只豚鼠予以1%戊巴比妥鈉麻醉后斷頭處死，并立即于冰上開顱，快速取出雙側(cè)聽皮層組織，并用4℃的生理鹽水漂洗后拭干。精密天平準(zhǔn)確稱重，用聽皮層組織質(zhì)量9倍的0.9%生理鹽水一起研磨（在冰上進(jìn)行），隨后3000RPM離心10分鐘取上清液，使用BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測聽皮層組織的總蛋白濃度，置于負(fù)80℃冰箱保存。采用硫代巴比妥酸法，在波長532nm測其吸光度，計(jì)算出組織中MDA含量；采用黃嘌呤氧化酶法，在波長550nm測其吸光度，計(jì)算出組織中SOD活力；采用比色法，在波長412nm測其吸光度，計(jì)算出組織中GSH-px活力。

1.7 細(xì)胞色素C和Caspase-9免疫熒光檢測

每組取3只豚鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)心臟灌注，先用0.9%生理鹽水沖盡血液后，立即用4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，待頭頸完全僵硬后迅速斷頭，切取包含聽皮層部分的腦組織，置于4%多聚甲醛中固定過夜。然后包埋、切片，將聽皮層組織按照免疫熒光操作技術(shù)操作，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察染色情況，并拍照記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS23.0軟件處理所有數(shù)據(jù)，ABR采用配對樣本t檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）進(jìn)行描述。

2 結(jié)果

2.1 ABR

輻射前后ABR閾值檢測，提示各組豚鼠(Sham,2w/kg,4w/kg,10w/kg)在不同輻射強(qiáng)度下的聽閾均沒有明顯改變（t=-0.563,P=0.583,P＞0.05;t=-0.563,P=0.583,P＞0.05;t=-1.883,P=0.082,P＞0.05;t=-1.883,P=0.082,P＞0.05）（圖1）。

圖1 ABR聽閾的變化(n=7)Fig.1 Changes of ABR hearing thresholds(n=7)

2.2 曠場實(shí)驗(yàn)

與sham組相比，各實(shí)驗(yàn)組豚鼠的運(yùn)動總行程（F=0.465,P=0.709,P＞0.05）、平均速度（F=0.458,P=0.714,P＞0.05）、中央格停留時間（F=1.465,P=0.249,P＞0.05）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖2 3500MHz EMR對焦慮行為的影響。A：總路程（m）；B：平均速度（cm/s）；C：中央格停留時間（S）；(n=7)Fig.2 Effects of 3500MHz EMR on anxiety-like behaviors.A:the distance covered(m)B:average speed(cm/s)C:inner zone time(s);(n=7)

2.3 MDA含量及SOD、GSH-px活力

與sham組相比，MDA含量在各輻射組（2w/kg、4w/kg、10w/kg）中明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.378,P=0.002,P＜0.05）。與sham組相比，SOD活力及GSH-px活性在2w/kg、4w/kg、10w/kg組中均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.019,P=0.018,P＜0.05;F=7.142,P=0.005,P＜0.05）；且隨著SAR值增大，MDA含量呈逐漸上升趨勢，而SOD、GSH-Px活力呈逐漸下降趨勢（表1）。

表1 3500MHz EMR對豚鼠聽皮層組織MDA含量及SOD、GSH-px活性的影響Table 1Effects of 3500MHz EMR on the content of MDA and the activities of SOD、GSH-px in auditory cortex

2.4 免疫熒光

與sham組相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)強(qiáng)烈的紅色熒光信號，提示Cyt C從線粒體釋放入細(xì)胞胞漿內(nèi)。聽皮層在EMR輻射72小時后，2w/kg組（圖3B）、4w/kg組（圖3C）、10w/kg組（圖3D）Cyt C的表達(dá)出現(xiàn)逐漸增加的趨勢；而Sham組熒光信號微弱（圖3A）。圖4顯示各輻射組細(xì)胞胞漿內(nèi)Caspase-9紅色免疫熒光信號較假輻射組明顯升高，且Caspase-9熒光信號隨著SAR值增加而增強(qiáng)，以10w/kg組最顯著（圖4D）。

圖3 免疫熒光檢測細(xì)胞色素C的釋放（×400）。A：假輻射組：呈現(xiàn)微弱的紅色熒光信號；B：2w/kg組，C：4w/kg組，D：10w/kg組；B、C、D各組呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的紅色熒光信號，以10w/kg最明顯。Fig.3 The release of Cyt c detected by IF（×400）.A:Sham group,very slight Cyt C positive cells were observed in sham group;B:2w/kg group,C:4w/kg group,D 10w/kg:increase of Cyt C was observed at 2w/kg、4w/kg、10w/kg groups,it reached the highest level at 10w/kg after exposure to EMR.

圖4 免疫熒光檢測Caspase-9的表達(dá)（×400）。A：假輻射組：呈現(xiàn)微弱的紅色熒光信號；B：2W/kg組，C：4W/kg組，D：10W/kg組；B、C、D各組呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的紅色熒光信號，以10w/kg最明顯。Fig.4 The expression of caspase 9 detected by IF（×400）.A:Sham group,very slight caspase-9 positive cells were observed in sham group;B:2w/kg group,C:4w/kg group,D10w/kg:increase of caspase-9 was observed at 2w/kg、4w/kg、10w/kg groups,it reached the highest level after 10w/kg exposure to EMR

3 討論

手機(jī)是現(xiàn)代社會交流傳遞信息的不可缺少的工具，雙耳和大腦是手機(jī)EMR的主要靶器官，對人體的影響是近年來研究的熱點(diǎn)，尤其是聽覺系統(tǒng)的影響一直存在爭議。在公眾人群中，Oktay[15]對40名使用手機(jī)超過4年、使用時長不同的健康成人行ABR檢查，發(fā)現(xiàn)10-20min/天的手機(jī)使用人群ABR閾值無明顯改變，但2h/天的手機(jī)使用人群ABR閾值升高；Gupta[16]對67名使用手機(jī)超過1年的成人行ABR檢查，未見明顯異常。在特殊人群中，Oktay[17]發(fā)現(xiàn)長期職業(yè)暴露于EMR可提高ABR閾值。然而我們前期研究發(fā)現(xiàn)SD大鼠急性（48h）或慢性（1h/天，連續(xù)48天）暴露于1800MHz（4G），ABR閾值均沒有明顯改變；但Maskey[18]研究發(fā)現(xiàn)小鼠間斷暴露于EMR3個月可升高ABR閾值。本次研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組在2、4、10w/kg輻射強(qiáng)度下，ABR反應(yīng)閾值均無明顯升高（P＞0.05），表明短期暴露于3500MHz（5G）EMR，即使在10w/kg（職業(yè)暴露）的輻射強(qiáng)度下，ABR閾值無顯著改變，考慮是由于本實(shí)驗(yàn)是以ABR作為評估聽覺改變的功能性指標(biāo)，豚鼠的ABR波形反映的是從耳蝸聽神經(jīng)到外側(cè)丘系或下丘的功能狀態(tài)，但并不能反映聽皮層的功能狀態(tài)，因此，聽皮層的病變不能引起ABR波形的改變，本課題組擬進(jìn)一步探討暴露于EMR后聽皮層的聽覺誘發(fā)電位情況。

活性氧簇（Reactive oxygen species,ROS）是生物體內(nèi)一系列具有高度活性的氧自由基的統(tǒng)稱。ROS系統(tǒng)的激活是手機(jī)EMR產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制[13,19]，過量的ROS可導(dǎo)致氧化損傷作用。氧化損傷是指機(jī)體內(nèi)的氧自由基的產(chǎn)生與清除之間出現(xiàn)嚴(yán)重失衡時,氧自由基對細(xì)胞及組織的一系列損害作用。丙二醛（MDA）是氧自由基參與脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物，它能夠引起機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)等生物大分子的交聯(lián)聚合及酶喪失活性,其含量的高低可直接反映組織細(xì)胞受氧化損傷的程度。SOD及GSH-px是主要的抗氧化系統(tǒng)，SOD能清除機(jī)體內(nèi)部多余的自由基，有效阻止氧自由基造成的損傷，并具有修復(fù)損傷細(xì)胞的功能。GSH-px可結(jié)合氧自由基及過氧化物，參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)，在細(xì)胞抗氧化過程中起重要作用，其降低后可增加ROS的生成，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。MDA、SOD和GSH-px是評價(jià)氧化損傷和抗氧化能力的重要指標(biāo)。在體外研究中，Xu[20]發(fā)現(xiàn)暴露于1800MHz EMR可引起原代皮層神經(jīng)元線粒體DNA損傷，并導(dǎo)致活性氧（ROS）含量增加；在動物實(shí)驗(yàn)中，Alkis[21]發(fā)現(xiàn)暴露于900MHz、1800MHz、2100MHz EMR 6個月可引起大鼠腦組織的DNA損傷，MDA及8-hydroxydeoxyguanosine(8-OHdG)生 成 增 加 ；Esmekaya[22]發(fā) 現(xiàn)900MHz EMR導(dǎo)致大鼠心臟、睪丸、肺、肝臟組織的氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為MDA、NO生成增加，GSH-px活性降低。以往的文獻(xiàn)都傾向于研究不同頻率及強(qiáng)度的EMR對海馬、耳蝸、肝臟、生殖系統(tǒng)等的影響，我們的實(shí)驗(yàn)首次研究3500MHz EMR對聽皮層的影響。與上述研究結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與sham組相比，各輻射組聽皮層組織MDA含量均明顯增加，而SOD、GSH-px活力均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,且隨著SAR值增大，豚鼠聽皮層組織MDA含量呈上升趨勢，而SOD、GSHPx活力呈下降趨勢。表明在各輻射組中ROS的清除能力下降，并隨著輻射強(qiáng)度的增加而愈加明顯，導(dǎo)致聽皮層組織細(xì)胞損傷，即便在2w/kg輻射強(qiáng)度下，3500MHz（5G）手機(jī)急性電磁輻射亦能誘發(fā)聽皮層氧化應(yīng)激損傷。

線粒體是氧化應(yīng)激的主要部位，Cyt C是線粒體中的一個細(xì)胞凋亡因子，在呼吸鏈電子傳遞和細(xì)胞凋亡中起著重要作用，線粒體Cyt C可通過對凋亡信號的傳導(dǎo)和放大來調(diào)控細(xì)胞凋亡。Cyt C在正常情況下定位于線粒體膜，在誘導(dǎo)因素的刺激下釋放至胞漿。Caspase家族是一高度保守的半胱氨酸蛋白酶家族，其啟動蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，對凋亡的起始和執(zhí)行起著重要作用。據(jù)報(bào)道，手機(jī)電磁輻射可上調(diào)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡通路[23]；也有報(bào)道表明暴露于2450MHz電磁輻射下28天，可導(dǎo)致海馬組織線粒體功能紊亂及細(xì)胞色素C的釋放從而激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑[24]。在本實(shí)驗(yàn)中，各暴露組聽皮層的Cyt C在胞漿中表達(dá)，且隨著SAR值增高，表達(dá)逐漸增強(qiáng)。釋放入胞漿中的Cyt C可結(jié)合凋亡蛋白激活因子-1（Apaf-1），Apaf-1與Caspase-9結(jié)合后形成凋亡復(fù)合體，再裂解并激活下游的Caspase，從而誘導(dǎo)凋亡。而活化的Caspase-9也可促進(jìn)線粒體釋放Cyt C，形成正反饋環(huán)路，促進(jìn)更大規(guī)模Caspase激活和細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激一直是包括焦慮在內(nèi)的精神和神經(jīng)疾病的研究焦點(diǎn)。Rammal[25]和Bouayed[26]在焦慮小鼠的外周血和大腦神經(jīng)元細(xì)胞中均檢測到ROS的累積，且氧化應(yīng)激水平與焦慮程度呈正相關(guān)。越來越多的證據(jù)也表明，線粒體的功能與焦慮存在雙向聯(lián)系，線粒體功能的改變可能導(dǎo)致焦慮；相反，在焦慮人群中可檢測到線粒體功能的改變[27]。ROS系統(tǒng)的激活是手機(jī)EMR產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要機(jī)制，因此我們進(jìn)行了曠場實(shí)驗(yàn)。曠場實(shí)驗(yàn)常用于評價(jià)動物的活動量及焦慮情緒，它的設(shè)計(jì)原理基于齲齒類動物的趨避性，即此類動物在未知的新環(huán)境中表現(xiàn)出的貼墻活動的特征[14]。有研究報(bào)道，將大鼠暴露于EMR（900MHz，4h/天）持續(xù)15天可增加大鼠的焦慮水平[28]；而另一組研究發(fā)現(xiàn)，將大鼠暴露于EMR（900MHz,2h/天，5天/周）持續(xù)5周，大鼠未表現(xiàn)出明顯的焦慮行為[29]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和后者一致。在本次實(shí)驗(yàn)中，各輻射組和sham組中豚鼠的活動總路程、中心區(qū)域停留時間和平均速度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明我們的電磁輻射模式?jīng)]有增加豚鼠的焦慮行為，這可能是因?yàn)榫€粒體氧化應(yīng)激損傷和凋亡僅僅是引起焦慮行為的一部分誘因，線粒體的能量代謝、鈣離子濃度、神經(jīng)類固醇激素的變化等都對焦慮行為產(chǎn)生重要影響。此外，焦慮行為是由一個包括大腦皮層、海馬、杏仁、腦干等多個區(qū)域的腦回路共同調(diào)節(jié)管理[27]。不同的物種和EMR暴露參數(shù)也會對焦慮行為產(chǎn)生影響。我們擬進(jìn)一步研究電磁輻射對豚鼠焦慮行為的作用機(jī)制。

根據(jù)國際非電離輻射委員會（ICNIRP）相關(guān)規(guī)定，美國、歐洲和國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)手機(jī)SAR值設(shè)置上限通常是2w/kg，但手機(jī)在接通瞬間和通話過程中，腦組織吸收電磁能量可以達(dá)到4w/kg,職業(yè)暴露時達(dá)到了10w/kg[7,30]。本研究的初期，我們的研究模型是一個72h急性暴露模型。當(dāng)然，這樣的頻率和使用時間并不常見，但這種過度暴露可能在職業(yè)暴露和一些特殊的緊急情況下成為現(xiàn)實(shí)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)首次研究了3500MHz（5G）手機(jī)急性電磁輻射對豚鼠焦慮行為及聽皮層的影響，并得出如下結(jié)論：氧化應(yīng)激損傷是3500MHz（5G）手機(jī)急性電磁輻射產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的重要機(jī)制，損傷的氧化應(yīng)激系統(tǒng)可誘導(dǎo)線粒體細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而活化Caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且隨著SAR值增大，聽皮層損傷加重。然而，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)動物模型聽閾和曠場實(shí)驗(yàn)指標(biāo)無明顯變化，考慮與輻射時間、輻射強(qiáng)度等有關(guān)，本課題組擬進(jìn)一步通過延長暴露時間來驗(yàn)證手機(jī)電磁輻射的長期累積效應(yīng)。