宋婉雪江海英譚坦任繼鋒汪照國王炳玲段海平,*

1青島大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學（青島 266000）

2山東省青島市城陽區(qū)疾病預(yù)防控制中心(青島 266109)

3山東第一醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院公共衛(wèi)生專業(yè)（泰安 271000）

4山東省青島市疾病預(yù)防控制中心（青島 266011）

年齡相關(guān)性聽力減退(Age-related Hearing Impairment,ARHI)，又稱為老年性耳聾(Presbycusis)，是一種嚴重影響老年人生活質(zhì)量的感音神經(jīng)性耳聾[1]。它表現(xiàn)為隨個體年齡的增加而出現(xiàn)的雙耳對稱性、漸進性聽力降低，首先是高頻聽力的下降，然后逐漸擴展到中低頻率聽力水平，最后發(fā)展成為全頻聽力水平的降低[2]?；加蠥RHI后不僅會對老年人的正常交流產(chǎn)生障礙，而且會使得老年人對于報警聲等高頻率聲音不敏感，導(dǎo)致心理上孤獨感產(chǎn)生以及生活危險性增加[3]。隨著老年人口數(shù)逐漸增大，ARHI的患病情況不容樂觀，預(yù)計在2025-2040年間導(dǎo)致我國老年人聽力殘疾原因主要是由ARHI引起的[4]，可見研究與ARHI發(fā)生有關(guān)的因素具有重要的疾病預(yù)防和人群意義。

現(xiàn)代醫(yī)學研究證實ARHI與遺傳因素和環(huán)境因素均有關(guān)[5,6]。目前提及較多的非遺傳因素有環(huán)境噪聲、吸煙、過度飲酒、高血壓以及高血糖等[5,7,8]。還有多項研究顯示40%-50%ARHI發(fā)病是由遺傳因素所導(dǎo)致的[7,9]。以雙胞胎隊列和家庭隊列為研究對象的縱向研究表明，ARHI的遺傳度為25%-75%[10]。以往人類遺傳學研究已經(jīng)報道了許多ARHI相關(guān)基因，如 GRM7、SIK3、ESRRG、SOD2、GSTM1、GRHL2、TRIOBP等[6,11,12]。然而，關(guān)于糖皮質(zhì)激素受體基因(Nuclear Receptor Subfamily 3,Group C,Member 1,NR3C1)與ARHI關(guān)系的研究很少。NR3C1基因在體內(nèi)可以編碼生成糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid Receptor,GR）。人內(nèi)耳組織及實驗動物研究表明GR主要分布于內(nèi)耳的螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋、Corti器中并且發(fā)揮著重要的生理作用[13]。

本研究旨在探討青島地區(qū)漢族老年人群中NR3C1基因與ARHI之間的關(guān)系，探究NR3C1基因的遺傳易感性。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象

通過整群隨機抽樣方法抽取青島地區(qū)漢族非相關(guān)個體作為研究對象，本研究經(jīng)青島市疾病預(yù)防控制中心醫(yī)學倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書并且自愿參與本項研究。

納入標準：（1）年齡≥60歲的中老年人；（2）青島市常住漢族居民（＞5年）；（3）能很好的配合此次的所有調(diào)查項目。排除標準：（1）有影響聽力的疾病史、暴露史及用藥史者；（2）無法配合完成問卷及各項檢查者。

1.2 問卷調(diào)查

使用統(tǒng)一的調(diào)查方法、調(diào)查表進行調(diào)查，為了避免產(chǎn)生由于調(diào)查人員詢問方式方法產(chǎn)生的偏倚，在調(diào)查前對調(diào)查工作人員進行統(tǒng)一培訓(xùn)。調(diào)查過程中選擇安靜的隔音房間、舒適的座椅、引導(dǎo)員維護秩序并對調(diào)查過程監(jiān)督、一對一的詢問等方法消除環(huán)境因素的影響。

問卷調(diào)查內(nèi)容主要包括：研究對象的基本情況、吸煙飲酒情況、飲食和運動情況。研究對象基本情況包括：年齡、性別、DHI量表評分、是否對骨質(zhì)疏松了解、身高改變與否、是否服用抗骨質(zhì)疏松藥物、糖尿病、心血管疾病、慢性肝病、骨密度、BMI、腰圍、臀圍。吸煙和飲酒情況包括：吸煙頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）、吸煙量（每天0根/6根及以下/7-12根/13-18根/19根及以上）、飲酒頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）、飲酒量（每次0ml/50ml及以下/50-99ml/100-149ml/150ml及以上）、被動吸煙頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）。飲食和運動情況包括：飲綠茶和紅茶頻率（每周＜1次/每周1-3次/每周4-6次/每天1次/每天2-3次/每天4次及以上）、食堅果、油炸食品和牛奶的攝入頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）、是否食用刺激性食物、是否每日蔬菜攝入、水果攝入（每周1-2次/3-4次/5-6次/7次及以上）、餐次（1/2/3）、幾分飽（節(jié)食/七分飽/飽腹/過飽）、運動頻率（從不/偶爾/經(jīng)常）和運動時間（半小時/1小時左右/超過1小時）。

1.3 純音聽閾測試

測試前首先對研究對象進行外耳道清潔，休息片刻后進入指定符合規(guī)定的房間[≤40dB(A)]內(nèi)由專業(yè)人員進行聽力測試。使用純音聽力計（Orbiter 922,Madsen）并遵循《聲學 測聽方法》（GB/T 16296.1-2018）規(guī)定對研究對象使用上升法進行聽力測試。從受試者自述聽力較好耳開始分別測量左右兩耳0.5、1.0、2.0、4.0kHz的純音氣導(dǎo)聽閾，讀數(shù)精確到1dB HL。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織1997年的推薦標準，以聽力較好耳0.5、1.0、2.0、4.0kHz的純音聽閾平均值作為聽力水平的判斷標準：（1）≤25dB HL為聽力水平正常；（2）＞25dB HL為患有ARHI。

1.4 基因分型

依據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫和1000 Genomes選擇候選基因的啟動子、5′-非翻譯區(qū)（5′-UTR）、內(nèi)含子和3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）等的功能性 SNP 位點，須滿足在CHB人群中MAF＞0.05。最終，納入NR3C1基因的9個SNP，分別是rs6191、rs61757411、rs41400245、rs258751、rs6196、rs41423247、rs6877893、rs12655166和rs33388。

根據(jù)SNP位點序列信息并采用AssayDesigner 3.1軟件進行引物設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物，并交由青島歐易生物科技有限公司合成。NR3C1基因SNP位點的合成引物序列詳見表1。

采集受試者4ml外周靜脈血置于裝有EDTA抗凝劑的試管中，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂贸善坊疍NA提取試劑盒（BioTeKe Corporation）提取血樣中的DNA。然后通過PCR反應(yīng)擴增出含有待檢SNP位點的目的片段，然后用SAP酶去除PCR體系中剩余的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,再加入單堿基延伸引物，這樣探針在SNP位點處僅延伸一個堿基。用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)檢測延伸產(chǎn)物與未延伸引物間的分子量差異,確定該點處堿基。

表1 NR3C1基因SNP位點的合成引物序列Table 1 The synthetic primer sequence of SNP locus of NR3C1 gene

1.5 統(tǒng)計學分析

計數(shù)資料間比較使用χ2檢驗。單因素和多因素Logistic回歸探討NR3C1基因與ARHI的關(guān)系。我們也同時進行了Hardy-Weinberg平衡檢驗驗證樣本的群體代表性。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本特征比較

本次調(diào)查共納入研究對象共866人。其中男性347人（40.07%），女性519人（59.93%）。年齡為60-88歲。所有的SNP位點的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，說明樣本具有群體代表性。

2.2 ARHI組與聽力正常組間基因型分布情況比較

所有的SNP位點基因型分布在ARHI組和聽力正常組間均不存在顯著差異（P＞0.05），如表2所示。

2.3 ARHI組與聽力正常組間等位基因分布情況比較

rs61757411、rs41423247、rs6877893等位基因分布在ARHI組和聽力正常組間存在顯著差異（P＜0.01），如表3所示。

表2 ARHI組與聽力正常組NR3C1基因型分布比較Table 2 Genotype distribution of NR3C1 was compared between ARHI group and normal hearing group

表3 ARHI組與聽力正常組NR3C1等位基因分布比較Table 3 The distribution of NR3C1 allele was compared between ARHI group and normal hearing group

2.4 NR3C1基因單個SNP位點與ARHI的關(guān)系

對NR3C1基因9個SNP位點的共顯性、加性、顯性、隱性和超顯性五種遺傳模型分析，在ARHI組和聽力正常組的基因型頻率及與ARHI的相關(guān)結(jié)果見表4。在未調(diào)整任何協(xié)變量情況下的單因素Logistic回歸顯示，對NR3C1基因9個SNP位點的共顯性、加性、顯性、隱性和超顯性五種遺傳模型分析，所有的SNP位點與ARHI之間均不存在統(tǒng)計學意義上的關(guān)聯(lián)（P＞0.05）。

調(diào)整協(xié)變量基礎(chǔ)上的多因素Logistic回歸分析顯示，rs6877893位點的加性模型（GG vs AG vs AA）下該位點與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計學意義（OR=0.733，95%CI：0.543-0.989，P=0.042）。

調(diào)整協(xié)變量基礎(chǔ)上的多因素Logistic回歸分析顯示，rs33388共顯性模型（TT vs AT）先與攜帶TT基因型的個體相比，攜帶AT基因型的個體患有 ARHI的危險性將會降低（OR=0.672，95%CI：0.453-0.996，P=0.048）；加性模型（AA vs AT vs TT）提示該位點與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計學意義（OR=0.723，95%CI：0.536-0.974，P=0.033）；顯性模型提示相對于攜帶TT基因型的個體，攜帶（AT+AA）基因型的個體患有ARHI的危險性將會降低（OR=0.660，95%CI：0.454-0.960，P=0.030）。最后根據(jù)AIC選擇了共顯性模型為rs33388位點的最優(yōu)遺傳模型。

表4 NR3C1基因SNP位點與ARHI的關(guān)系Table 4 The relationship between SNP locus of NR3C1 and ARHI

C G 2 0 2 6 9 0.7 4 7（0.5 0 5-1.1 0 7） 0.1 4 6 C C 2 6 9 0.7 6 9（0.3 1 6-1.8 6 9） 0.5 6 2 A d d i t i v e C Cv s C Gv s G G 0.8 0 1（0.5 8 5-1.0 9 7） 0.1 6 7 7 5 5.4 4 5 D o m i n a n t G G 4 2 8 1 2 3 1.0（R e f.） 7 5 5.1 1 5 C G+C C 2 2 8 7 8 0.7 5 0（0.5 1 4-1.0 9 4） 0.1 3 5 R e c e s s i v e G G+C G 6 3 0 1 9 2 1.0（R e f.） 7 5 7.2 0 9 C C 2 6 9 0.8 5 0（0.3 5 4-2.0 4 4） 0.7 1 7 S u p e r d o m i n a n c e G G+C C 4 5 4 1 3 2 1.0（R e f.） 7 5 5.4 3 9 C G 2 0 2 6 9 0.7 6 1（0.5 1 6-1.1 2 1） 0.1 6 7 r s 6 8 7 7 8 9 3 C o d o m i n a n t A A 4 0 8 1 1 5 1.0（R e f.） 7 5 6.7 0 3 A G 2 1 8 7 4 0.7 1 5（0.4 8 4-1.0 5 6） 0.0 9 2 G G 3 1 1 3 0.5 6 4（0.2 5 8-1.2 3 2） 0.1 5 1 A d d i t i v e G Gv s A Gv s A A 0.7 3 3（0.5 4 3-0.9 8 9） 0.0 4 2 7 5 6.7 4 0 D o m i n a n t A A 4 0 8 1 1 5 1.0（R e f.） 7 5 7.0 3 A G+G G 2 4 9 8 7 0.6 9 1（0.4 7 6-1.0 0 2） 0.0 5 1 R e c e s s i v e A A+A G 6 2 6 1 8 9 1.0（R e f.） 7 5 9.5 2 5 G G 3 1 1 3 0.6 3 5（0.2 9 4-1.3 6 8） 0.2 4 6 S u p e r d o m i n a n c e A A+G G 4 3 9 1 2 8 1.0（R e f.） 7 5 8.6 8 3 A G 2 1 8 7 4 0.7 5 0（0.5 1 2-1.1 0 1） 0.1 4 2 r s 1 2 6 5 5 1 6 6 C o d o m i n a n t T T 5 0 1 1 5 7 1.0（R e f.） 7 5 8.9 3 6 C T 1 4 7 4 2 1.2 5 6（0.8 0 2-1.9 6 8） 0.3 1 9 C C 9 2 1.5 0 5（0.2 7 3-8.2 9 7） 0.6 3 9 A d d i t i v e C Cv s C Tv s T T 1.2 5 0（0.8 3 4-1.8 7 5） 0.2 8 0 7 5 8.9 3 9 D o m i n a n t T T 5 0 1 1 5 7 1.0（R e f.） 7 5 8.9 7 9 C T+C C 1 5 6 4 4 1.2 6 9（0.8 1 9-1.9 6 8） 0.2 8 7 R e c e s s i v e T T+C T 6 4 8 1 9 9 1.0（R e f.） 7 5 9.9 4 6 C C 9 2 1.4 4 2（0.2 6 2-1.9 2 9） 0.6 7 4 S u p e r d o m i n a n c e T T+C C 5 1 0 1 5 9 1.0（R e f.） 7 5 9.1 6 9 C T 1 4 7 4 2 1.2 4 9（0.7 9 8-1.9 5 6） 0.3 3 0 r s 3 3 3 8 8 C o d o m i n a n t T T 4 1 1 1 1 4 1.0（R e f.） 7 5 7.1 7 1 A T 2 1 3 7 5 0.6 7 2（0.4 5 3-0.9 9 6） 0.0 4 8 A A 3 4 1 3 0.5 9 9（0.2 7 7-1.2 9 7） 0.1 9 4 A d d i t i v e A Av s A Tv s T T 0.7 2 3（0.5 3 6-0.9 7 4） 0.0 3 3 7 5 7.4 8 4 D o m i n a n t T T 4 1 1 1 1 4 1.0（R e f.） 7 5 7.2 4 9 A T+A A 2 4 7 8 8 0.6 6 0（0.4 5 4-0.9 6 0） 0.0 3 0 R e c e s s i v e T T+A T 6 2 4 1 8 9 1.0（R e f.） 7 6 1.0 7 8 A A 3 4 1 3 0.6 8 9（0.3 2 3-1.4 7 1） 0.3 3 6 S u p e r d o m i n a n c e T T+A A 4 4 5 1 2 7 1.0（R e f.） 7 5 8.7 9 5 A T 2 1 3 7 5 0.7 0 3（0.4 7 8-1.0 3 4） 0.0 7 4

3 討論

人體隨著年齡的逐漸增加會出現(xiàn)各種老化的現(xiàn)象，比如皮膚組織表現(xiàn)為色斑以及皺紋增加，而ARHI發(fā)生正是因為聽覺系統(tǒng)逐漸衰老所導(dǎo)致的[2]。雖然人體都會經(jīng)歷逐漸衰老的過程，但是ARHI的發(fā)生時間、嚴重程度、進展速度卻存在明顯的個體差異。并且研究顯示ARHI發(fā)生與遺傳因素密切相關(guān)，所以研究ARHI的遺傳背景具有重要意義[7,9]。

本研究顯示 rs61757411、rs41423247、rs6877893等位基因分布在ARHI組和聽力正常組間存在顯著性差異。在控制環(huán)境因素的多因素Logistic回歸分析顯示，rs6877893位點的加性模型與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計學意義，rs33388共顯性模型、加性模型、顯性模型與ARHI之間關(guān)聯(lián)存在統(tǒng)計學意義，提示NR3C1基因多態(tài)性與ARHI存在關(guān)聯(lián)。目前對于NR3C1基因與ARHI之間的相關(guān)研究較少，一項非綜合征型耳聾研究從人或老鼠的耳蝸中分離到特異表達的耳聾候選基因中包含NR3C1基因[14]。有研究利用基因表達譜芯片在人群中對糖皮質(zhì)激素受體相關(guān)基因進行檢測顯示糖皮質(zhì)激素受體在ARHI組與對照組間基因表達存在不同，提示糖皮質(zhì)激素受體與ARHI存在相關(guān)[15]。其它對NR3C1基因研究顯示rs41423247位點與心血管疾病危險因素、腹型肥胖、高血壓、糖尿病存在相關(guān)性，這些因素均為目前研究揭示的ARHI危險因素，所以NR3C1基因多態(tài)性可能會引起內(nèi)耳循環(huán)改變的相關(guān)疾病從而導(dǎo)致ARHI的發(fā)生[16-18]。

NR3C1基因位于人體5號染色體上，由9個外顯子構(gòu)成，其編碼的糖皮質(zhì)激素受體（GR）屬于核激素受體超家族，并且研究表明GR在內(nèi)耳分布[13]。下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）分泌的GC對聽力的保護作用需要GR的參與[19]。動物實驗表明，患有ARHI小鼠內(nèi)耳存在毛細胞凋亡和聽神經(jīng)退行性改變[20]。GR介導(dǎo)的聽力保護可能與調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。抑制凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)Fas或Bcl-2蛋白家族中促凋亡成員的表達，上調(diào)Bcl-2蛋白家族中抗凋亡成員的表達均可發(fā)揮抗凋亡作用[11]。例如，地塞米松可能通過基因組作用上調(diào)Bcl-2和Bcl-x1來抵抗TNF-α的耳毒性作用[21]。耳蝸側(cè)壁的血迷路屏障(blood labyrinth barrier,BLB)可以將耳蝸微環(huán)境與血液循環(huán)隔離開來，長期以來人們認為內(nèi)耳內(nèi)是不存在免疫反應(yīng)的。然而，隨著深入研究發(fā)現(xiàn)ARHI患者的耳蝸有炎癥反應(yīng)。在60歲以下存在聽力減退的人群中血清TNF-α和CRP濃度顯著升高[22]。高齡小鼠耳蝸組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ROS的產(chǎn)生以及IL-1、IL-6、IL-18、TNF-α濃度顯著升高[23]。這都提示炎癥和免疫反應(yīng)是ARHI發(fā)生發(fā)展的重要機制。GC通過GR信號通路具有明顯的抗炎和免疫抑制作用。發(fā)揮主要抗炎作用的GR-α進入細胞核后，與DNA上的GC反應(yīng)元件結(jié)合使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，通過抗炎蛋白的表達影響轉(zhuǎn)錄過程，抑制炎癥反應(yīng)[24]。

本研究首次選取了青島地區(qū)漢族老年人群作為研究對象來探討NR3C1基因多態(tài)性與ARHI之間的關(guān)系，研究顯示NR3C1基因多態(tài)性與ARHI存在關(guān)聯(lián)性，提示今后可以考慮將NR3C1基因作為中老年人聽力篩查的目標基因。但是由于ARHI是一個多基因疾病，所以在聽力篩查中不應(yīng)僅將本次研究的NR3C1基因作為目的基因，還應(yīng)該結(jié)合以往的研究把有意義的基因也納入其中作為目的基因，比如：GRM7、SIK3、ESRRG、SOD2、GSTM1、GRHL2、TRIOBP等。SNP位點選取時可以考慮選擇研究報道過的有意義的位點對高危人群進行篩查，從而提高篩查的質(zhì)量。同時也應(yīng)把噪聲環(huán)境工作者以及受環(huán)境噪聲污染等人群也應(yīng)考慮在內(nèi)。經(jīng)篩查上述基因已呈現(xiàn)多態(tài)性時，應(yīng)考慮調(diào)離工作崗位、佩戴隔音耳塞、早期佩戴助聽器等積極有效措施延緩ARHI發(fā)病進程。這為今后開展多中心、大人群、多SNP位點的研究提供了重要參考，并且為ARHI高危人群的篩查和預(yù)防提供了科學依據(jù)。本研究尚有不足之處，rs61757411、rs41423247、rs6877893、rs33388外其余沒有顯著統(tǒng)計學意義的SNPs，我們考慮其原因可能是樣本量相對較小，在今后的研究中我們會繼續(xù)增加樣本量并且更深入的研究。