王 澤, 宋 揚(yáng), 秦林偉

(沈陽(yáng)師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 沈陽(yáng) 110034)

干細(xì)胞(stem cell,SC)是指在一定條件下具有無(wú)限自我更新增殖和限制性分化能力的一類細(xì)胞,它們能產(chǎn)生表現(xiàn)型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞,也能分化為某種特化細(xì)胞或祖細(xì)胞。按照來(lái)源可以分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell,ESC)和成體干細(xì)胞(adult stem cell),按照分化潛能可分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)和單能干細(xì)胞(monopotent stem cell)。ESC是典型的全能干細(xì)胞,有形成完整個(gè)體的分化潛能;間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,IPSC)為多能干細(xì)胞,具有產(chǎn)生多種類型細(xì)胞的能力,但是無(wú)法發(fā)育成完整的個(gè)體。3種干細(xì)胞在細(xì)胞移植、再生醫(yī)學(xué)、組織工程、毒性評(píng)價(jià)、神經(jīng)退行性疾病治療等領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值日益凸顯,并有望在疾病治療中替代傳統(tǒng)的藥物治療,已經(jīng)成為干細(xì)胞應(yīng)用領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1 胚胎干細(xì)胞的研究與應(yīng)用

1.1 胚胎干細(xì)胞的建系

胚胎干細(xì)胞是源于早期胚胎或原始性腺的一類全能性干細(xì)胞,具有典型的特征性表面標(biāo)志物如糖脂類SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4及蛋白多糖類TRA-1-60, TRA-1-81, GCTM2等,是ES建系鑒定、質(zhì)量評(píng)價(jià)及污染判定的標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的ESC培養(yǎng)多采用以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞等為主的有飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系,目前,ES的無(wú)血清無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系[1]、無(wú)動(dòng)物源性培養(yǎng)體系[2]、懸浮培養(yǎng)體系[3]等培養(yǎng)模式得到了廣泛的探討。ESC建系多來(lái)自動(dòng)物的桑椹胚、囊胚等胚胎組織,常用的分離方法有免疫外科法、機(jī)械分離法、酶消化法和單卵裂球法等。1981年首次成功分離獲得小鼠ES細(xì)胞,1988年Thomson等在建立靈長(zhǎng)類動(dòng)物恒河猴ES細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,成功建立人的ES細(xì)胞系。目前,已分離獲得了倉(cāng)鼠、大鼠、兔、豬、牛、綿羊、山羊、水貂、恒河猴、美洲長(zhǎng)尾猴等ES細(xì)胞。此外,Kim[4]通過(guò)激活小鼠卵母細(xì)胞的方法,分離得到了與受體免疫系統(tǒng)組織相容的胚胎干細(xì)胞系。劉佳等[5]利用孤雌激活的小鼠囊胚建立了2種形態(tài)和生物學(xué)特征極其接近ES的細(xì)胞系Pa-AFSCs和Ja-ASCs,極大地推進(jìn)了胚胎干細(xì)胞的醫(yī)療應(yīng)用進(jìn)程。

1.2 胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

理論上,ESC可以被誘導(dǎo)分化為3個(gè)胚層的所有細(xì)胞類型。目前,人ESCs(hESCs)可以人工誘導(dǎo)分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。由于ESCs在能量代謝、物質(zhì)代謝和大分子合成方面具有獨(dú)特的生理特征,ESCs的生長(zhǎng)、自我更新和分化譜系等受到其培養(yǎng)環(huán)境、細(xì)胞因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等因素的影響顯著,如高水平的蛋氨酸代謝對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)維持自我更新和多能性至關(guān)重要,蛋氨酸代謝水平降低可以促進(jìn)mESCs向3個(gè)胚層分化[6];體外培養(yǎng)基中加入BMP4, Activin A, BGFG和VEGF可以定向誘導(dǎo)mESCs向造血細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[7];單獨(dú)增加Activin A能夠顯著促進(jìn)hESCs向神經(jīng)外胚層細(xì)胞的分化。Park等[8]發(fā)現(xiàn)MAGEA2下調(diào)會(huì)引起mESCs發(fā)生多能性標(biāo)志基因表達(dá)的降低、S期細(xì)胞周期阻滯、caspase依賴的凋亡等生物學(xué)事件。利用shRNA抑制mESCs多梳家族蛋白PHC1的活性,可以上調(diào)mESCs定向分化為心肌細(xì)胞的分化效率[9]。mESC-PA6共培養(yǎng)的條件培養(yǎng)液可以顯著增強(qiáng)mESCs的神經(jīng)分化[10]。ESCs的定向誘導(dǎo)研究對(duì)于了解ESC的多能性、自我更新和系統(tǒng)分化等生物學(xué)過(guò)程和分子機(jī)制具有重要的科學(xué)價(jià)值。

1.3 胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用

胚胎干細(xì)胞現(xiàn)已成為研究早期胚胎發(fā)育途徑、疾病預(yù)防和藥物毒性的有力工具。臨床級(jí)別的hESC細(xì)胞系Q-CTS-hESC-2在非xeno條件下可分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞,在濕性黃斑的損傷區(qū)域可檢測(cè)到rpe樣細(xì)胞層的存在[11]。hESCs經(jīng)過(guò)定向誘導(dǎo)可分化為更接近髁突軟骨的細(xì)胞[12],為實(shí)現(xiàn)髁突軟骨的原位修復(fù)提供了一種更合適的和更有前景的工具細(xì)胞。使用CRISPR/Cas9n技術(shù)刪除臨床級(jí)hESC細(xì)胞系中內(nèi)源性SNCA基因,可以降低病患者腦內(nèi)路易體的發(fā)生率[13],為治療帕金森氏病(PD)提供了一種新的細(xì)胞替代治療策略。事實(shí)上,相對(duì)于其他干細(xì)胞,由于胚胎干細(xì)胞的分離和純化較為繁瑣、定向分化的機(jī)制尚不明朗等風(fēng)險(xiǎn)因素較難在臨床中大規(guī)模應(yīng)用,但是單倍體胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在基因組印記、遺傳篩選、基因突變細(xì)胞文庫(kù)構(gòu)建等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞的研究與應(yīng)用

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞的建系

間充質(zhì)干細(xì)胞,又稱多潛能基質(zhì)細(xì)胞,是源于中胚層和外胚層的多能干細(xì)胞,可以從結(jié)締組織或器官間質(zhì)分離獲得,研究顯示,使用基質(zhì)膠消化法得到的ADMSCs成脂、成骨分化潛力優(yōu)于直接消化法。DMEM/F12培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基等是MSCs體外培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基,培養(yǎng)體系中最適宜的鋅離子濃度為10-7mol/L,過(guò)高過(guò)低均損害骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力。程明等[14]利用質(zhì)粒和脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染,得到穩(wěn)定表達(dá)TERT基因的嶗山奶山羊BMSCs。目前,研究人員相繼建立了兔子、豬、鼠、牛、人等物種的間充質(zhì)干細(xì)胞系,為相關(guān)物種的繁育、種質(zhì)基因庫(kù)研究奠定了基礎(chǔ)。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

相對(duì)于其他成體干細(xì)胞,MSCs具有強(qiáng)大的增殖能力和多分化潛能,目前,MSCs可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞,同時(shí),國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)確定體外可誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的能力為MSCs鑒定的必檢指標(biāo)。MSCs的分化能力和分化方向受到信號(hào)通路、培養(yǎng)體系、關(guān)聯(lián)基因等因素的調(diào)節(jié)。徐弘遠(yuǎn)等[15]提出微環(huán)境可通過(guò)改變細(xì)胞骨架形狀、架構(gòu)等因素影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化趨向。賀繼剛等[16]研究發(fā)現(xiàn):miRNA-673-5p通過(guò)抑制TSC-1蛋白的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化,BMSCs的成骨分化受到多基因的調(diào)節(jié),如RAI3基因敲除可促進(jìn)BMSCs的體外和體內(nèi)成骨[17],過(guò)量表達(dá)Lgr5的BMSC表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨能力,抑制Lgr5表達(dá)會(huì)降低BM-MSC的成骨分化能力[18]。這為BMSC在骨再生中的應(yīng)用開(kāi)辟了廣泛的研究模型。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用

MSCs因其突出的抗氧化活性、免疫重構(gòu)等特性,是臨床研究和應(yīng)用最為深入的干細(xì)胞。其中,美國(guó)批準(zhǔn)了60余項(xiàng)間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床試驗(yàn),已成為阿爾茨海默病、漸凍癥等疾病的新興治療方案。腦室內(nèi)注射的BMSCs可以通過(guò)改善星形細(xì)胞炎癥和誘導(dǎo)突觸發(fā)生,修復(fù)AD模型小鼠的認(rèn)知障礙[19],BMSCs移植可以通過(guò)抑制T細(xì)胞的增殖和活化,減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,阻止實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的發(fā)展;通過(guò)增強(qiáng)胞葬作用,促進(jìn)心肌I/R大鼠心肌炎癥的消退[20]。劉廣洋等[21]研究發(fā)現(xiàn)MSCs可以通過(guò)抑制肺部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞減輕急慢性肺損傷。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSCs)因其來(lái)源方便的特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于急性心肌梗死治療、急性肝臟衰竭、腦損傷記憶障礙、造血調(diào)控等方面的探討研究。AMSCs鞘內(nèi)移植可以改善脊髓栓系綜合征大鼠后肢運(yùn)動(dòng)能力,有效促進(jìn)其損傷神經(jīng)的修復(fù)[22],AMSCs大鼠左側(cè)海馬CA3區(qū)移植可以增強(qiáng)癲癇大鼠血清及海馬組織中的自由基清除能力,有效改善機(jī)體的氧化應(yīng)激效應(yīng)。外泌體是間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌的重要組成部分,源于hMSCs的外泌體能夠抑制成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞系的增殖和遷移,促進(jìn)其凋亡,為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供新的治療策略[23]。富含miR-17-92簇的mMSCs外泌體可以被大鼠周圍神經(jīng)末梢攝取,并逆行運(yùn)輸?shù)角敖堑腄RG神經(jīng)元和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,大大增加了中風(fēng)大鼠神經(jīng)可塑性、神經(jīng)發(fā)生和功能恢復(fù)[24]。小鼠腦損注射hADSC-ex后,優(yōu)先被小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞攝取,并通過(guò)NF-κB和p38-MAPK信號(hào)通路減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而改善大鼠創(chuàng)傷性腦損傷微環(huán)境,促進(jìn)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù)[25]。外泌體為間充質(zhì)干細(xì)胞在組織損傷修復(fù)、抗炎治療、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物運(yùn)載體研發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的視角。

3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的研究與應(yīng)用

3.1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的建系

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是通過(guò)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子將終末分化的體細(xì)胞重新編程逆轉(zhuǎn)為多能性干細(xì)胞。2006年日本京都大學(xué)Shinya Yamanaka利用病毒載體將轉(zhuǎn)錄因子Oct4, c-Myc, Kif4, Sox2導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞,獲得首例iPSCs,目前,約有10個(gè)基因可以參與體細(xì)胞向iPSCs的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。iPSC性狀與ESC相似,具有相同的二倍體核型、高度的自我更新能力。但是,iPSC建系完成后往往需要從細(xì)胞和組織功能水平等方面進(jìn)行鑒定排查,如胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物是否表達(dá)、啟動(dòng)子去甲基化程度、是否致畸胎瘤等。目前,國(guó)內(nèi)外構(gòu)建的人iPSC系多來(lái)源于羊水細(xì)胞、尿細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。其中,尿源性細(xì)胞因?yàn)楦菀撰@取、成本低廉、無(wú)創(chuàng)傷,重編程效率高,同時(shí)不受性別、年齡和身體狀況等實(shí)驗(yàn)因素干擾的優(yōu)勢(shì)而廣受關(guān)注。

3.2 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化

目前,iPSC細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為生殖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、破骨細(xì)胞、胰島分泌細(xì)胞等終末分化細(xì)胞,甚至間充質(zhì)多能性干細(xì)胞。Kitajima等[26]將黑猩猩成年皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSCs,并重建了早期神經(jīng)發(fā)育過(guò)程,為更好地理解黑猩猩及人腦神經(jīng)發(fā)育的分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)提供了有力的工具[27]。UQCRC1 p.Y314S突變的外周血單個(gè)核細(xì)胞可以誘導(dǎo)建立iPSCs系,并在體內(nèi)向3個(gè)胚層分化[27];利用癲癇患者外周單核細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生了攜帶PIK3R2雜合突變的人iPSC細(xì)胞系,不僅能夠分化為3個(gè)胚層,并表達(dá)內(nèi)源性多能性標(biāo)記物,使得更好地理解癲癇及其早期用藥篩選成為可能[28]。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不僅影響體細(xì)胞向iPSC細(xì)胞系的重編程過(guò)程,同時(shí)可以決定iPSC特定細(xì)胞系的分化形成[29]。Hepburn等[30]借助誘導(dǎo)性泌尿生殖竇間充質(zhì)共培養(yǎng)技術(shù),大大提高了iPSC體內(nèi)外分化為前列腺組織的成功率。高通量測(cè)序結(jié)果顯示,通過(guò)調(diào)節(jié)與TGF-β信號(hào)通路microRNAs 的表達(dá)可以促進(jìn)hiPSCs向NSCs的誘導(dǎo)分化[31]。

3.3 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)用

事實(shí)上,iPSC細(xì)胞系因其無(wú)倫理障礙、來(lái)源容易、免疫排斥小、強(qiáng)分化能力等獨(dú)特優(yōu)勢(shì),開(kāi)啟了細(xì)胞治療、發(fā)育分化研究、疾病模型建立及藥物評(píng)價(jià)的新紀(jì)元。自體皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的iPSCs移植可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,如有效緩解大鼠的急性肺損傷和減少炎癥因子釋放,改善小鼠腎組織損傷并對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有一定的治療作用。iPSCs技術(shù)的成熟極大地推動(dòng)了神經(jīng)組織損傷修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)的研究進(jìn)程,研究人員首次成功地將人血細(xì)胞直接重新編程成為神經(jīng)板邊界干細(xì)胞,這些iPSCs可以產(chǎn)生神經(jīng)嵴和中樞神經(jīng)系統(tǒng)譜系的功能細(xì)胞類型,并可以通過(guò)基因編輯技術(shù)建模人類疼痛綜合征[32]。吳軒[33]完成了iPSCs定向分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,為神經(jīng)疾病模型構(gòu)建和治療研究提供了優(yōu)秀的細(xì)胞模型。此外,小鼠右側(cè)腦室內(nèi)注射的iPSCs通過(guò)歸巢效應(yīng),可顯著減少缺氧缺血性腦病新生小鼠神經(jīng)元的丟失和修復(fù)腦損傷。研究顯示,hiPSCs可以被定向誘導(dǎo)為人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和光感受器,穩(wěn)定或者恢復(fù)動(dòng)物模型視力。此外,利用帶有疾病基因的體細(xì)胞重編程的iPSCs,為發(fā)病機(jī)制、藥物開(kāi)發(fā)以及治療方案的研究提供了更加真實(shí)的開(kāi)發(fā)平臺(tái),利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)建立的Peptide transporter-ko iPSCs被用于腸道藥物吸收效力的研究[34],多重耐藥基因1-ko iPSCs為MDR1潛在底物評(píng)估與藥代動(dòng)力學(xué)測(cè)試提供了良好的研究模型[35],但是,真正應(yīng)用于人類治療的iPSCs細(xì)胞來(lái)源方案和移植程序等仍然需要優(yōu)化和驗(yàn)證。

MSCs,iPSCs和EMCs在組織損傷修復(fù)、疾病模型建立、藥物評(píng)價(jià)等應(yīng)用領(lǐng)域均具有各自明顯的優(yōu)勢(shì),同時(shí)也面臨著諸多挑戰(zhàn)和應(yīng)用短板。在安全性方面,ESCs和MSCs的致瘤系數(shù)遠(yuǎn)大于iPSCs,ESCs的倫理道德受限、維持未分化狀態(tài)時(shí)間短、遺傳不穩(wěn)定、誘導(dǎo)分化效率低等狀況大大限制了其在臨床上的深入應(yīng)用。iPSCs技術(shù)的重要性在于其打破了干細(xì)胞研究中不可回避的倫理道德和免疫排斥等局限,為干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和研究提供了一個(gè)全新的視角,但值得注意的是,截至目前,不同組織、器官來(lái)源或不同發(fā)育階段的體細(xì)胞生成iPSCs的效率和安全性仍存在較大差別。因此,干細(xì)胞研究領(lǐng)域未來(lái)在某些領(lǐng)域仍需要突破性成果來(lái)促進(jìn)其應(yīng)用價(jià)值的發(fā)揮,例如: 1)闡明其增殖、分化的內(nèi)部機(jī)制,以促進(jìn)神經(jīng)科學(xué)、心臟病學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中的疾病模型的建立與應(yīng)用;2)基因組編輯工具在干細(xì)胞領(lǐng)域的成熟運(yùn)用,以提高干細(xì)胞應(yīng)用的安全性和穩(wěn)定性;3)廣泛利用組織工程學(xué)、3D支架技術(shù)對(duì)培養(yǎng)體系進(jìn)行改造,提高干細(xì)胞應(yīng)用的可重復(fù)性和標(biāo)準(zhǔn)化等。