蔡亞文，張暄，陳鷗，鄧麗莉,3，曾凱芳,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué))，重慶，400715)3(西南大學(xué),食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

李果實(shí)是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)性鮮食水果，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特。近年來重慶李果實(shí)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但在李果實(shí)采摘運(yùn)輸過程中，不可避免的產(chǎn)生碰撞、切割等機(jī)械傷，從而為病原菌侵染提供了機(jī)會。其中，由美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola，M.fructicola)引起的褐腐病是造成其采后損失的主要真菌性病害[1]。長期以來，化學(xué)殺菌劑被廣泛應(yīng)用于果蔬采后病害防治，但污染環(huán)境、產(chǎn)生抗藥性等弊端[2]日益顯著；熱激處理[3]、超聲波清洗[4]、涂膜[5]等方式毒性較小，但單獨(dú)使用對病害控制效果不佳，實(shí)際應(yīng)用受限，因此尋找更加有效的防治方法已成為研究重點(diǎn)。

生物防治是一種高效廣譜且環(huán)保的新興技術(shù)，目前已有關(guān)于微生物揮發(fā)性有機(jī)物[6]、籃狀菌[7]及單胞菌[8]的相關(guān)研究。生防酵母因其生存力強(qiáng)、能快速利用營養(yǎng)物質(zhì)、可與其他保鮮方式結(jié)合使用、遺傳學(xué)基礎(chǔ)明確等多種優(yōu)點(diǎn)[9]，已在桃[10]、柑橘、葡萄[11]等多種水果的采后病害防治中表現(xiàn)出較好生防潛力。誘導(dǎo)抗性是酵母發(fā)揮生物防治效果的重要機(jī)制之一[12]，膜醭畢赤酵母[13]、羅倫隱球酵母[14]等均有誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗病性的作用。拮抗酵母常通過激活機(jī)體的苯丙烷代謝來增強(qiáng)宿主抗病性[15]，提高果實(shí)自身防御能力以抵御病原菌的侵襲。研究表明，苯丙烷代謝途徑對機(jī)械脅迫可產(chǎn)生積極的抗性防御作用，可通過苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase，PAL)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、肉桂酸-4-羥基化酶(cinnamate-4-hydroxylase，C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid coenzyme-A-ligase，4CL)等關(guān)鍵酶調(diào)控抗性物質(zhì)的積累[16-17]。ZHANG等[18]將膜醭畢赤酵母接種于桃果實(shí)后，發(fā)現(xiàn)宿主的苯丙烷代謝酶被激活，從而誘發(fā)宿主的抗性防御作用；膜醭畢赤酵母、檸檬形克勒克酵母處理李果實(shí)后，其木質(zhì)素、總酚、類黃酮等代謝產(chǎn)物含量上升，果實(shí)抗病性增強(qiáng)[19]。

Pichiagaleiformis(P.galeiformis)分離于檸檬果實(shí)表面，能有效控制柑橘采后綠霉病[20]，在果蔬采后病害防治顯示出較大的應(yīng)用潛力。王友升等[21]研究表明，P.galeiformis可控制多種水果采后病害，但不同拮抗酵母對特定病原菌的生防效果及抗菌機(jī)理不同，且目前尚未深入研究其抗病機(jī)制。因此，探討李果實(shí)接種P.galeiformis后苯丙烷代謝的變化對于深入了解李果實(shí)抗病機(jī)理及褐腐病害控制具有重要意義。

綜上所述，本研究旨在探究P.galeiformis對李果實(shí)采后褐腐病的生防效果，并初步揭示P.galeiformis誘導(dǎo)李果實(shí)抗病性的苯丙烷相關(guān)機(jī)制，以期為P.galeiformis在果蔬采后病害防治中的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用李果實(shí)為巫山“脆紅李”，采后6 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，剔除病、傷、畸果，挑選大小、成熟度一致的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料，預(yù)冷后放入0 ℃冷庫中貯藏待用。

1.2 主要試劑

瓊脂粉、酵母浸膏、牛肉膏(均為生物級)、葡萄糖、H3PO4、次氯酸鈉、濃HCl、MgCl2、抗壞血酸、H2O2、鄰苯二酚、四硼酸鈉、溴乙酰、NaOH、硼酸、硼砂、甘油(均為分析純)，成都科龍化工試劑廠；無水乙醇、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、MgSO4(均為分析純)，天津瑞金化學(xué)品有限公司；愈創(chuàng)木酚(化學(xué)純)，中國佘山化工廠；甲醇(色譜級)，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF)(均為生化試劑)、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、輔酶A(coenzyme A，CoA-SH)(均為優(yōu)級純)，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、?-巰基乙醇(均為生化試劑)，Sigma；L-苯丙氨酸(生化試劑)，上?？颠_(dá)氨基酸廠；對香豆酸(優(yōu)級純)，上海阿達(dá)瑪斯有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

BXM30R立式高壓滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；Avanti TM J-30I高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；SW-CJ-1F超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；B203生物顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑有限公司；WD-9405B水平搖床，北京市六一儀器廠；KQ52DE超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；UV-1000紫外分光光度計(jì)，日本島津。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1M.fructicola孢子懸浮液的制備

將病原菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)7～8 d，用無菌水清洗孢子，4層紗布過濾，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，無菌條件下用無菌水配制成1×105spores/mL孢子懸浮液。

1.4.2P.galeiformis菌懸液的配制

活化：將凍存干酵母以無菌水沖洗、稀釋，接種于NYDA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，重復(fù)傳代2次；液體培養(yǎng)：接種于NYDB培養(yǎng)基，200 r/min，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h；離心分離：5 000 r/min，4 ℃離心10 min，無菌水洗滌2次；重懸浮及濃度確定：無菌水再懸浮，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用前無菌水分別稀釋至1×108cells/mL、5×108cells/mL。

1.4.3P.galeiformis對M.fructicola菌落直徑的影響

將0.2 mL處理液(1)無菌水、(2)酵母菌懸液(1×108cells/mL)分別涂布于PDA平板，放置10 min后在平板中間打孔接入培養(yǎng)5 d的M.fructicola菌餅(直徑5 mm；取自菌落邊緣)，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從平板背面采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑。

1.4.4P.galeiformis處理對李果實(shí)采后褐腐病的控制效果

同孔損傷接種：果實(shí)隨機(jī)分組，用1%(體積分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液浸泡1 min，清水沖凈，在20 ℃，相對濕度(relative humidity，RH)為80%～90%環(huán)境下自然風(fēng)干。用1 mL無菌槍頭在果實(shí)赤道部位等距打2個孔(深3 mm，直徑3 mm)，每個傷口接種20 μL，1×108cells/mL酵母細(xì)胞懸液。以等量無菌水處理為對照。4 h后每個孔中接種10 μL，1×105spores/mLM.fructicola孢子懸浮液。待處理液吸收后，單果包裝，20 ℃貯藏，每天統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。每組10個果實(shí)，重復(fù)3組。

異孔損傷接種：分組清洗處理同上。用1 mL無菌槍頭在果實(shí)赤道部位等距打2個孔(深3 mm，直徑3 mm)，每個傷口接種20 μL，1×108cells/mL酵母細(xì)胞懸液。以等量無菌水處理為對照。24 h后，在果實(shí)原來孔徑右邊1 cm左右打1個新孔(直徑3 mm，深3 mm)，并在該孔中接種10 μL，1×105spores/mLM.fructicola孢子懸液。待處理液吸收后，單果包裝，20 ℃貯藏，每天統(tǒng)計(jì)果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。每組10個果實(shí)，重復(fù)3組。

浸泡處理：分組清洗處理同上。分別在無菌水和酵母細(xì)胞懸液(5×108cells/mL)中浸泡3 min，自然晾干，用1 mL無菌槍頭在果實(shí)赤道部位等距離刺孔2個(深3 mm，直徑3 mm)，接種10 μL，1×105spores/mL病原菌孢子懸浮液。待菌液吸收后單果包裝，20 ℃貯藏，PE膜覆蓋保濕。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑直徑,如公式(1)、公式(2)所示。每組10個果實(shí)，重復(fù)3組。

(1)

(2)

1.4.5P.galeiformis處理對李果實(shí)苯丙烷代謝途徑相關(guān)酶活性及代謝產(chǎn)物積累的測定

1.4.5.1 樣品處理及取樣方法

選擇果色均勻，大小、成熟度一致果實(shí)，用1%(體積分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液浸泡1 min，清水沖洗，自然晾干后用1 mL無菌槍頭在果實(shí)赤道部位等距離刺2個孔(深3 mm，直徑3 mm)。每個傷口加入20 μL以下溶液：(1)對照組-無菌水；(2)酵母菌懸液(5×108cells/mL)。待菌液吸收后，貯藏于20 ℃、RH為85%～90%，PE膜覆蓋保濕。

取樣方法：常溫條件在貯藏第0(以接種后1 h為起始點(diǎn))、1、2、3、4、5天取樣，取樣部位為果實(shí)打孔傷口外1 cm直徑的健康果實(shí)組織，去除傷口及發(fā)病部位。每組10個果實(shí)，每種處理重復(fù)3組。該樣品用于相關(guān)酶活及物質(zhì)含量的測定。

1.4.5.2 PAL和POD活性的測定

PAL活性測定參照ASSIS等[22]的方法并適當(dāng)修改。取2 g樣品，加入5 mL 100 mmol/L硼酸-硼砂鹽緩沖液(pH 8.8，含5 mmol/L ?-巰基乙醇，2 mmol/L EDTA，40 g/L PVP)，冰浴研磨，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，上清液低溫保存?zhèn)溆?。反?yīng)液為0.5 mL酶提取液；3 mL 50 mmol/L硼酸-硼砂緩沖液(pH 8.8)；0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸溶液。對照以等量H2O代替酶液。反應(yīng)體系置于37 ℃保溫60 min后，立即加入0.1 mL 6 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，蒸餾水為參比，分別測定290 nm處吸光度值，以1 h吸光值變化0.01為1個酶活力單位(U)。重復(fù)3次。

POD活性測定參照曹建康等[23]的方法并適當(dāng)修改。取2 g樣品，加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L pH 6.8磷酸緩沖液(含40 g/L PVP)，冰浴研磨后于4 ℃、12 000 r/min離心20 min。反應(yīng)體系為2.7 mL 0.1 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)，0.1 mL 4%(體積分?jǐn)?shù))愈創(chuàng)木酚，0.1 mL 0.5%(體積分?jǐn)?shù)) H2O2和0.1 mL上清液，測定470 nm處室溫下反應(yīng)3 min吸光值變化，蒸餾水為參比。以1 min吸光值變化1為一個酶活力單位(U)。重復(fù)3次。

1.4.5.3 C4H和4CL活性的測定

C4H活性測定參照范存斐等[24]的方法并適當(dāng)修改。取1 g樣品，加入5 mL 200 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.5，含2 mmol/L ?-巰基乙醇)，冰浴研磨，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液備用。反應(yīng)液為2 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液，1 mL 2 mmol/L反式肉桂酸，100 μL 0.5 mmol/L氧化型輔酶Ⅱ二鈉(triphosphopyridine nucleotide disodium salt，NADP-Na2)，100 μL 0.5 mmol/LD-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(D-glucose 6-phosphate disodium salt hydrate，G-6-P-Na2)，50 μL酶提取液；200 μL 6 mol/L HCl終止反應(yīng)，于340 nm處測定吸光值，以不加酶液為參比。OD值每l h變化0.01為1個酶活性單位(U)。

4CL活性測定參照LI等[25]的方法并適當(dāng)修改。稱取2 g樣品，加5 mL 100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)提取液(含15 mmol/L ?-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)30%甘油)，冰浴研磨，超聲破碎2 min(25 ℃、100 W)，4層紗布過濾，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，上清液為粗酶提取液。反應(yīng)體系為0.5 mL酶提取液，0.15 mL 5 μmol/L對香豆酸；0.15 mL 5 μmol/L ATP；0.15 mL 1 μmol/L CoA；0.45 mL 15 μmol/L MgSO4。對照以H2O取代酶液。25 ℃反應(yīng)10 min，333 nm測定吸光值，以O(shè)D值每1 min變化0.001為1個酶活性單位(U)，重復(fù)3次。

1.4.5.4 總酚、類黃酮、木質(zhì)素含量的測定

總酚、類黃酮的測定參考DENG等[26]的方法并稍作修改。取1 g樣品，加入20 mL預(yù)冷的1%(體積分?jǐn)?shù)) HC1-甲醇溶液充分研磨提取，取1 mL濾液加5 mL 1% HCl-甲醇提取液，搖勻后立即用于比色。分別以1 g鮮重在280、325 nm處吸光度值表示總酚、類黃酮含量，表示為OD280/g FW、OD325/g FW，重復(fù)3次。

木質(zhì)素含量測定參照LI等[27]的方法并修改。取1 g 樣品，加5 mL 95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇研磨，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，沉淀物以3 mL 95%乙醇沖洗3次，3 mLV(乙醇)∶V(正己烷)=1∶2 溶液離心沖洗3次，收集沉淀物，65 ℃干燥12 h。干燥物溶于3 mL 25%(體積分?jǐn)?shù))溴乙酰冰醋酸溶液，70 ℃恒溫水浴中加塞保溫30 min(每隔一段時間開塞散熱)，加0.9 mL 2 mol/L NaOH終止反應(yīng)，冰醋酸定容至10 mL，9 000 r/min離心10 min，取上清液0.5 mL加9.5 mL蒸餾水，以蒸餾水為參比，280 nm處測定吸光值。以1 g鮮重在280 nm處的吸光值表示木質(zhì)素含量(OD280/g FW)，重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)整理，SPSS 25對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan′s多重比較對差異顯著性進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著，用Origin 9.1軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下P.galeiformis對M.fructicola菌落直徑的影響

經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)，確定P.galeiformis的最佳抑菌濃度為1×108cells/mL。如圖1所示，經(jīng)P.galeiformis(1×108cells/mL)涂布的PDA平板上，M.fructicola的菌落直徑增長幅度較小、擴(kuò)散生長慢。接種7 d時，P.galeiformis處理組菌落直徑為對照組的22.84%。MARTA等[28]、ZHAO等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在最佳抑菌濃度下，酵母處理可顯著抑制褐腐病病原菌生長，顯示出增強(qiáng)抗病性的潛力。

A-對照(無菌水)；B-P.galeiformis處理組(1×108 cells/mL)

2.2 P.galeiformis處理對李果實(shí)褐腐病的生物防治效果

接種后李果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑情況如圖2所示。如圖2-A所示，同孔損傷接種時，P.galeiformis處理組果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑顯著低于對照組(P<0.05)。在貯藏第3天，對照組李果實(shí)有明顯病變，發(fā)病率為28.01%，P.galeiformis處理組發(fā)病率為1.67%。7 d時，對照組發(fā)病率超過80%且病斑直徑為12.66 mm，而P.galeiformis處理組發(fā)病率為對照組的23.38%，病斑直徑為2.96 mm。如圖2-B所示，異孔損傷接種時，3～5 d內(nèi)P.galeiformis處理可明顯抑制李果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大，5 d時對照組果實(shí)病斑直徑擴(kuò)大至6.22 mm，達(dá)P.galeiformis處理組的1.55倍。5～7 d中，P.galeiformis處理組與對照組發(fā)病率、病斑直徑差異顯著(P<0.05)。貯藏第7天，對照組發(fā)病率達(dá)100%，而P.galeiformis處理組發(fā)病率為78.76%。同異孔損傷接種結(jié)果表明，P.galeiformis可能具有分泌抗菌物質(zhì)的作用，但并不是其主要的抗菌機(jī)制，這與王智榮等[8]研究結(jié)果類似。如圖2-C所示，P.galeiformis處理對M.fructicola有較好的拮抗效果，貯藏4 d時，對照組李果實(shí)發(fā)病率達(dá)P.galeiformis處理組的1.80倍，差異顯著(P<0.05)。整個貯藏期內(nèi)，P.galeiformis處理組果實(shí)的病斑直徑顯著低于對照組，在接種第6、7天對照組李果實(shí)病斑直徑分別為酵母處理組的1.20、1.28倍。SHAO等[30]、LIU等[31]在用Candidaintermedia和Pichiakudriavzevii控制桃果實(shí)采后病害時發(fā)現(xiàn)，酵母對病原菌的強(qiáng)拮抗作用是防止水果發(fā)生病變的重要原因。綜合同孔、異孔損傷接種及浸泡處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，P.galeiformis處理能延緩李果實(shí)褐腐病的發(fā)病進(jìn)程、降低果實(shí)腐爛程度，且該作用可能與誘導(dǎo)李果實(shí)產(chǎn)生抗病性有關(guān)。

A-同孔損傷處理發(fā)病率；B-異孔損傷處理發(fā)病率；C-浸泡處理發(fā)病率；D-同孔損傷處理病斑直徑；E-異孔損傷處理病斑直徑；F-浸泡處理病斑直徑

2.3 P.galeiformis處理對李果實(shí)抗病性的影響

2.3.1P.galeiformis處理對李果實(shí)PAL和POD活性的影響

PAL是苯丙烷代謝途徑中首個作用酶，對增強(qiáng)果實(shí)抗性有加速作用；POD參與了果實(shí)木質(zhì)素等結(jié)構(gòu)物質(zhì)的代謝和積累，是貯藏中典型的防御相關(guān)酶。由圖3可知，P.galeiformis處理顯著提高了李果實(shí)PAL、POD活性，可為后續(xù)酶活性的增強(qiáng)和抗性物質(zhì)的積累做準(zhǔn)備，從而增強(qiáng)果實(shí)抗性。

如圖3-A所示，果實(shí)PAL酶活性上升，P.galeiformis處理組與對照組變化趨于一致。48 h后，經(jīng)P.galeiformis處理李果實(shí)PAL酶活顯著高于對照，貯藏72 h時，P.galeiformis處理組PAL的活性與對照組差異最為顯著，達(dá)對照組1.29倍(P<0.05)。這與MAHUNU[32]用Pichiacaribbica防治蘋果青霉病時發(fā)現(xiàn)的抗性反應(yīng)類似，酵母處理有效刺激了PAL酶活性的顯著上升，增強(qiáng)了果實(shí)抗性反應(yīng)能力。張婕[19]將P.membranaefaciens接種于李果實(shí)發(fā)現(xiàn)，酵母處理可通過強(qiáng)化PAL酶活性調(diào)控產(chǎn)生香豆酸、阿魏酸等中間代謝產(chǎn)物從而繼續(xù)催化苯丙烷代謝作用。

如圖3-B所示，果實(shí)POD酶活性在貯藏期內(nèi)呈穩(wěn)定增長趨勢。與對照組相比，P.galeiformis處理組果實(shí)POD活性升幅明顯上調(diào)，貯藏第48、72、96、120 h時，P.galeiformis處理組POD酶活性分別為對照組的1.37、1.31、1.15、1.16倍，差異顯著(P<0.05)。ZHANG[33]研究表明，接種Pichiaguilliermondii能夠誘導(dǎo)PAL、POD在果實(shí)中的基因表達(dá)，從而激活果實(shí)苯丙烷代謝。POD作為具有多種功能的氧化還原酶，可直接調(diào)控果實(shí)防御機(jī)制及激素合成；同時，POD酶產(chǎn)物醌類等多酚氧化產(chǎn)物的增加，可有效增強(qiáng)果實(shí)在貯藏期間對病原菌的抵抗能力。吳鋒[34]在探究PichiamembranaefaciensY4對桃褐腐病的抗病機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)酵母可通過活化POD酶促進(jìn)細(xì)胞壁木質(zhì)化，從而提高果實(shí)抗病性。

A-PAL活性；B-POD活性

2.3.2P.galeiformis處理對李果實(shí)C4H和4CL活性的影響

C4H、4CL與植物體內(nèi)抗性物質(zhì)的合成積累密切相關(guān)，XU等[35]研究表明C4H、4CL是植物苯丙烷代謝的關(guān)鍵分支點(diǎn)酶。如圖4-A所示，C4H酶活性呈先升后降趨勢，于72 h達(dá)峰值。72 h時，P.galeiformis處理組果實(shí)C4H酶活性較對照組高35.71%(P<0.05)。與對照相比，P.galeiformis處理顯著增強(qiáng)了李果實(shí)貯藏期間C4H酶活性，末期雖有所下降，但仍維持在較高的活性水平。這可能是由于C4H作為植物中典型的P450單加氧化酶[36]，參與著植物進(jìn)化的多種分支代謝。ZHANG等[37]研究中也發(fā)現(xiàn)類似作用，C4H可參與植物組織向香豆酸的多個分支代謝，激活4CL酶活性，抑制蘋果的灰霉病感染。

如圖4-B所示，P.galeiformis處理能有效誘導(dǎo)果實(shí)4CL活性上升，在觀測的48 h及以后促進(jìn)作用尤為顯著(P<0.05)，在48、72、96、120 h時，P.galeiformis處理組果實(shí)4CL酶活性分別為對照組的1.38、1.20、1.30、1.33倍。4CL在植物中常以基因家族形式存在，是苯丙烷代謝途徑總支向不同的次生代謝產(chǎn)物合成的轉(zhuǎn)折點(diǎn)[39]，Pt4CL1對木質(zhì)素的合成反應(yīng)有較強(qiáng)催化效率，Pt4CL2可為酚類化合物的合成提供底物酶，從而為貯藏后期抗性物質(zhì)的積累做準(zhǔn)備。同時，4CL酶與PAL酶活性存在著一定的伴隨效應(yīng)，PAL酶代謝產(chǎn)物肉桂酸，可經(jīng)由4CL酶作用直接向分支代謝[40]，從而加速抗性物質(zhì)的合成。相似研究結(jié)果在和趙亞婷等[40]的研究中也有報(bào)道，但與本實(shí)驗(yàn)酶活性高峰出現(xiàn)的時間不同，這可能是由于酶在不同水果中的表達(dá)情況不同。綜上，P.galeiformis處理可通過活化C4H、4CL來調(diào)控果實(shí)抗性代謝從而增強(qiáng)其抗侵染能力，這與張培嶺等[41]對甜瓜抗病性的研究結(jié)果類似。

A-C4H活性；B-4CL活性

2.3.3P.galeiformis處理對李果實(shí)總酚、類黃酮和木質(zhì)素含量的影響

酚類化合物具有抗真菌活性并能提高植物抗性，類黃酮在植物發(fā)育和植物防御中均起著結(jié)構(gòu)和信號分子的重要作用[36]。WANG等[42]研究表明，硝普鈉可提高PAL酶活性并刺激總酚類、黃酮類積累，從而激活甜瓜的防御機(jī)制提高果實(shí)抗病性。如圖5-A所示，整個貯藏期內(nèi)酵母處理組總酚含量始終高于對照組，在貯藏120 h時，P.galeiformis處理組總酚含量比對照組高19.91%(P<0.05)。如圖5-B所示，P.galeiformis處理組與對照組的類黃酮含量呈下降-上升-下降趨勢，但在整個波動區(qū)間內(nèi)，P.galeiformis處理組類黃酮含量較對照組更高，在96 h時為對照組的1.23倍(P<0.05)。研究結(jié)果表明，P.galeiformis可以作為抗性激發(fā)子，在PAL、POD、C4H、C4L等酶的綜合調(diào)控下刺激果蔬體內(nèi)的總酚、類黃酮積累，以提升抗性作用；同時，酚類被PAL酶氧化后的毒素也可能對病原菌產(chǎn)生直接的抑制作用，如蘋果采后P.guilliermondii處理可激活果實(shí)創(chuàng)面的活性氧和苯丙烷代謝，促進(jìn)果實(shí)創(chuàng)面愈合[34]。

植物木質(zhì)素是多種苯丙烷單體的共聚物，酚類化合物和類黃酮是木質(zhì)素合成的重要前體物質(zhì)[44]，木質(zhì)素的積累預(yù)示著植物愈傷組織的形成和木質(zhì)化進(jìn)程加快，因此可以通過監(jiān)測木質(zhì)素來衡量李果實(shí)對病原菌的抗性作用。如圖5-C所示，貯藏期內(nèi)對照組果實(shí)的木質(zhì)素含量增加緩慢；經(jīng)P.galeiformis處理后，果實(shí)木質(zhì)素積累顯著上升，貯藏120 h時，P.galeiformis處理組木質(zhì)素含量達(dá)對照組1.52倍(P<0.05)。周雅涵[44]將P.membranaefaciens接種于柑橘果實(shí)發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素含量的增加可以增強(qiáng)細(xì)胞壁抗真菌穿透的能力，同時有效限制真菌對果實(shí)中水及營養(yǎng)物質(zhì)的利用。此外，木質(zhì)素中的自由基可有效鈍化真菌的細(xì)胞膜及其有害代謝產(chǎn)物，進(jìn)而增強(qiáng)果實(shí)的抗性。綜上，P.galeiformis可以通過調(diào)控李果實(shí)苯丙烷代謝途徑中類黃酮、總酚、木質(zhì)素等抗真菌化合物的代謝與積累，增強(qiáng)果實(shí)的結(jié)構(gòu)抗性和生化抗性，提高果實(shí)的抗病原菌侵染能力。

A-總酚含量；B-類黃酮含量；C-木質(zhì)素含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：(1)P.galeiformis能顯著抑制M.fructicola的菌絲生長，有效抑制李果實(shí)采后褐腐病的發(fā)病率和病斑直徑；(2)P.galeiformis可有效提高李果實(shí)苯丙烷代謝途徑中的關(guān)鍵酶(PAL、POD、C4H、4CL)活性，促進(jìn)其抗性物質(zhì)(總酚、類黃酮)代謝，顯著增強(qiáng)李果實(shí)木質(zhì)素積累，從而誘導(dǎo)李果實(shí)產(chǎn)生抗性提高其對病原體的防御反應(yīng)。因此，P.galeiformis有望成為一種控制李褐腐病的安全有效工具，在果蔬采后病害防治領(lǐng)域中有較大的應(yīng)用潛力，可為果蔬采后病害防治提供新的策略。