羅春萍， 陸友利，王星星(臺州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺州 318020)

0 引言

苯酚-硫酸法是常用的測定多糖含量的方法之一[1]，該方法利用多糖在濃硫酸作用下，水解成單糖，并迅速脫水生成糠醛衍生物，然后再與苯酚縮合生成具有紫外吸收特性的有色化合物進(jìn)行比色測定，具有操作簡單、顯色組分相對穩(wěn)定、重復(fù)性好等優(yōu)點[2-3]。苯酚-硫酸法多采用紫外分光光度計進(jìn)行檢測，由于受到比色槽數(shù)量的限制，測定多個樣品時，操作較繁瑣，比較費時，且實驗過程中消耗較多濃硫酸并產(chǎn)生大量廢液，對操作人員和環(huán)境易造成危害[4]。酶標(biāo)儀與紫外分光光度計的測試原理相同[5]，但具有96個比色槽，可批量完成多個樣品的測定，大大提高檢測效率。因此，本研究以酶標(biāo)儀代替紫外分光光度計為測定儀器，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過實驗優(yōu)化苯酚-硫酸法測定多糖的反應(yīng)條件，探索多糖批量快速檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；WD-2102A全自動酶標(biāo)儀 北京六一生物科技有限公司；96孔單條可拆酶標(biāo)板 海門捷泰實驗器材有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗溶液的配制

(1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)200mg，用蒸餾水溶解并定容至100mL，配成2.0mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品母液；然后分別移取0、1、2、3、4、5mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品母液，置于100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，搖勻，即得濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)5%苯酚溶液的配制。取一個干燥小燒杯稱取5g固體苯酚，加蒸餾水溶解并定容至100mL，轉(zhuǎn)至棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 檢測波長的確定

移取100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL加入試管中，以1mL蒸餾水作空白，室溫下加入5%苯酚溶液1mL、濃硫酸5mL，迅速搖勻后，置40℃水浴反應(yīng)10min，冷水終止反應(yīng)，紫外分光光度計掃描400～600nm波長范圍的吸光度，以最大紫外吸收波長作為酶標(biāo)儀檢測的波長。

1.2.3 單因素試驗設(shè)計

以100μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL為研究對象，酶標(biāo)儀檢測波長為490nm時的OD值作為評價指標(biāo)，分別考察苯酚用量(100、200、300、400、500μL)、濃硫酸用量(600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500μL)、反應(yīng)溫度(30、40、50、60、70、80、90、100℃)、反應(yīng)時間(5、10、15、20、25、30、40、50、60min)等因素對OD490nm值的影響[6]。

1.2.4 正交優(yōu)化試驗

在1.2.3單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇苯酚用量(A)、濃硫酸用量(B)和反應(yīng)溫度(C)3個因素為自變量，以O(shè)D490nm值為評價指標(biāo)，進(jìn)行L9(33)正交試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以蒸餾水為空白，分別精密吸取濃度為0、20、40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液各200μL加入2mL具塞塑料離心管中，在每支離心管中加入5%苯酚溶液200μL、濃硫酸700μL后，迅速搖勻，80℃水浴10min后，冷水浴5min終止反應(yīng)，精密吸取各反應(yīng)液加入96孔酶標(biāo)板，每個樣品加3個孔，每孔200μL，采用酶標(biāo)儀在490nm波長下測定OD值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，OD490nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 酶標(biāo)儀測定多糖的可行性分析

精密吸取濃度為40、60、80、100μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液各200μL加入2mL具塞塑料離心管中，按照1.2.5的操作方法加入苯酚、濃硫酸反應(yīng)后，酶標(biāo)儀測定OD490nm值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶標(biāo)儀檢測波長的確定

采用苯酚-硫酸法對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，于紫外可見分光光度計上，在400～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在490nm處有最大吸收峰，故可選擇490nm作為酶標(biāo)儀檢測波長。

圖1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖的紫外吸收光譜圖

2.2 單因素實驗結(jié)果

由圖2(A～C)可知，苯酚用量為200μL、硫酸用量為700μL、反應(yīng)溫度為80℃時，OD490nm值最大；圖2D可知，不同反應(yīng)時間下，OD490nm值保持一個相對穩(wěn)定的水平，說明葡萄糖與苯酚-硫酸能在較短時間內(nèi)發(fā)生比較徹底的化學(xué)反應(yīng)，生成物的量基本保持不變；為能保證化學(xué)反應(yīng)完全，且便于實驗操作，故選取實驗反應(yīng)時間為10min。

圖2 苯酚用量

2.3 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對苯酚用量、濃硫酸用量、反應(yīng)溫度三因素進(jìn)行正交試驗，結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果

通過對R值的分析可知，RA＞RC＞RB，即各反應(yīng)條件對OD490nm值的影響大小依次為苯酚用量＞反應(yīng)溫度＞濃硫酸用量。從K值的分析中可知，較佳的反應(yīng)條件為A2B2C2，即苯酚用量200μL，濃硫酸用量700μL，反應(yīng)溫度80℃。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制與檢測結(jié)果

以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，OD490nm值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，得到回歸方程為y=0.0076x-0.01118，R2=0.9989，說明當(dāng)葡萄糖濃度在 0～100μg/mL范圍內(nèi)，酶標(biāo)儀測定結(jié)果線性關(guān)系良好。

圖3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用酶標(biāo)儀測定不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的OD490nm值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出葡萄糖濃度，與已知濃度比較，結(jié)果如表3所示。從表中數(shù)據(jù)可以看，采用酶標(biāo)儀測得的葡萄糖溶液的濃度與已知濃度非常接近，說明采用該方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確。

表3 酶標(biāo)儀測得的葡萄糖溶液的濃度與已知濃度比較

3 結(jié)語

本研究以酶標(biāo)儀代替紫外分光光度計，對苯酚-硫酸法測定多糖的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出苯酚-硫酸法的最佳測定條件為：苯酚用量200μL、濃硫酸用量700μL、反應(yīng)溫度80℃、反應(yīng)時間10min，以該方法反應(yīng)繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2可達(dá)0.9989，且能得到準(zhǔn)確可靠的測定結(jié)果，為多糖快速批量測定方法的開發(fā)提供了新策略。