吳成亮 蘇占營 辜敏 巢時斌

[摘要] 目的 探討在卵子冷凍液中添加合適濃度的褪黑素能否改善卵子存活率和受精能力。方法 回顧性分析2017年3月至2020年10月在本中心進行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）時臨床廢棄未受精卵母細胞（判斷標準：受精評估時無原核和第二極體出現(xiàn)），根據(jù)實驗目的不同，分為兩個階段。第一階段探尋最佳的褪黑素添加濃度，經(jīng)過第一階段實驗分析發(fā)現(xiàn)添加10-9 M濃度組卵子存活率最高（88.64% vs. 74.12%，P<0.05）;第二階段實驗是用玻璃化冷凍及解凍方法冷凍及解凍卵子后進行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI），觀察及分析10-9 M褪黑素添加組172枚（51.04%）和對照組（未添加褪黑素）165枚（48.96%）卵子受精能力。 結果 在冷凍液添加褪黑素后卵子冷凍復蘇存活率明顯改善，褪黑素濃度10-9 M為效果最佳（88.64% vs. 84.93% vs. 84.21% vs. 74.12%，P<0.05），添加10-9 M褪黑素組比未添加褪黑素組卵子正常受精率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（66.86% vs. 51.52%，P<0.01）。結論 褪黑素可以顯著改善卵子冷凍復蘇效果。

[關鍵詞] 褪黑素;卵子冷凍;存活率;受精

[中圖分類號] R321? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）34-0028-03

[Abstract] Objective To investigate whether adding a suitable concentration of melatonin to the oocyte freezing solution can improve the oocyte survival rate and fertilization ability. Methods A retrospective analysis was conducted on the unfertilized oocytes during intracytoplasmic sperm injection（ICSI） in our center from March 2017 to October 2020 （judgment criteria： no pronucleus and second polar body appear during fertilization assessment）. According to the different purposes of the experiment， it was divided into two stages. In the first stage， the optimal melatonin concentration was explored. After the first stage of experimental analysis， it was found that the egg survival rate of the 10-9 M concentration group was the highest （88.64% vs. 74.12%， P<0.05）. The second stage of the experiment was to freeze and thaw the eggs by vitrification and thawing， and then perform intracytoplasmic sperm injection（ICSI）. The fertilization abilities of 172 （51.04%） eggs in the 10-9 M melatonin group （with 10-9 M melatonin added） and 165 （48.96%） eggs in the control group （without melatonin added） were observed and analyzed. Results After melatonin was added to the freezing solution， the oocyte survival rate during freezing and resuscitation was significantly improved， and the melatonin concentration of 10-9 M was the optimal concentration（88.64% vs. 84.93% vs. 84.21% vs. 74.12%， P<0.05）. The normal fertilization rate of oocyte in the 10-9 M melatonin group was significantly higher than that in the control group， with the difference statistically significant （66.86% vs. 51.52%， P<0.01）. Conclusion Melatonin can significantly improve the effect of oocyte freezing and resuscitation.

[Key words] Melatonin; Oocyte freezing; Survival rate; Fertilization

人類輔助生殖技術經(jīng)過40多年的發(fā)展，已經(jīng)取得了巨大的進步。在生育力保存領域也取得了較好的效果，尤其是在胚胎冷凍方面，玻璃化冷凍技術的成熟應用，使胚胎冷凍復蘇存活率提升到95%以上[1-2]。但是卵子冷凍技術的應用目前還不是十分的成熟，原因在于卵子的超微結構不同于胚胎，不論是傳統(tǒng)的慢速程序化冷凍技術還是玻璃化冷凍技術，都對冷凍卵子的超微結構、卵膜的滲透性、線粒體功能等方面有不可逆的損傷[3-4]。因此導致冷凍復蘇后卵子的存活率低，發(fā)育潛能差[5]。

本研究擬驗證在卵子冷凍液中添加合適濃度褪黑素改善卵子冷凍復蘇效果。此外，卵子冷凍技術的進步緩慢另一個重要原因是因為人類卵子稀缺和珍貴性及必須符合倫理監(jiān)督原則，臨床無法提供足量的樣本進行深入研究。本研究采用進行單精子卵胞漿內(nèi)注射技術后16～18 h受精觀察時未受精卵子（未見原核形成和第二極體排出），這些卵子無任何臨床使用價值，臨床的處理原則是直接丟棄，但是這部分卵子能夠保持一定的受精能力，具有一定的科研價值。這樣既可以獲得同樣的研究效果又可以在符合倫理監(jiān)督原則的條件下獲得足量的樣本，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2017年3月至2020年10月在本中心進行卵胞漿內(nèi)單精子注射（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）時臨床廢棄未受精卵母細胞（判斷標準：受精評估時無原核和第二極體出現(xiàn)），本試驗經(jīng)醫(yī)學倫理委員會審查與批準。告知患者本研究的目的，并由患者本人簽署知情同意書。

1.2方法

根據(jù)實驗目的不同分為兩個階段。第一階段探尋最佳的褪黑素添加濃度，將322枚卵母細胞分為4組：對照組 85枚（26.40%），卵子冷凍液中未添加褪黑素;10-7 M組76枚（23.60%），卵子冷凍液中添加10-7 M褪黑素（默克西格瑪化學品公司，美國）;10-9 M組88枚（27.33%），卵子冷凍液中添加10-9 M褪黑素;10-11 M組73枚（22.67%），卵子冷凍液中添加10-11 M褪黑素。經(jīng)過第一階段實驗分析發(fā)現(xiàn)添加10-9 M濃度組卵子存活率最高，因此第二階段實驗目的是比較10-9 M褪黑素添加組172枚（51.04%）和對照組（未添加褪黑素）165枚（48.96%）-卵子受精能力。第一階段實驗觀察指標為卵子存活率，第二階段實驗觀察指標為卵子受精率。玻璃化冷凍和解凍：玻璃化冷凍方法見參考文獻[6]，將卵母細胞轉移至平衡液（加藤，日本）中10 min后，轉移至玻璃化冷凍液（加藤，日本）中，在30 s內(nèi)將卵母細胞裝載到冷凍載桿（加藤，日本）并迅速投入液氮。玻璃化解凍將冷凍載桿從液氮罐中取出迅速放預溫至37℃解凍液1液的Nunc四孔皿中，解剖鏡下吸出所有卵子，60 s內(nèi)快速解凍后將卵子轉移至解凍液2中放置3 min;最后轉移至解凍液3、4中各5 min。復蘇后轉移到G1（Vitrolife，瑞典）培養(yǎng)液在5%CO2、5%O2、90%N2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。

1.3統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 卵子冷凍液中褪黑素濃度與卵子復蘇存活率關系

在冷凍液添加褪黑素后卵子冷凍復蘇存活率明顯改善，褪黑素濃度10-9 M為效果最佳，添加10-9 M褪黑素組卵子凍存復蘇后存活率與對照組（88.64% vs. 74.12%）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 未添加褪黑素組與添加褪黑素組卵子受精率比較

添加10-9 M褪黑素組比未添加褪黑素組卵子正常受精率明顯升高（66.86% vs. 51.52%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2。

3討論

玻璃化冷凍法是在輔助生殖技術的基礎上不斷發(fā)展起來的冷凍保存技術，可將細胞或組織在短時間內(nèi)快速冷凍[7-8]。玻璃化冷凍法在生殖醫(yī)學領域的廣泛應用，為成功凍存卵母細胞帶來了曙光。盡管人類卵母細胞的低溫保存技術已經(jīng)得到了提高，雖然取得了較高的存活率，但仍不能常規(guī)應用于臨床實踐中，因卵母細胞低溫保存后發(fā)育潛能受損，受精能力和胚胎發(fā)育能力都低于新鮮卵子。大量的研究表明，使用常規(guī)玻璃化冷凍方法冷凍卵子在復蘇后發(fā)現(xiàn)卵子超微結構破壞，線粒體功能受損，卵薄膜滲透性改變。和新鮮卵子比較，冷凍卵子受精率、優(yōu)質胚胎形成率及囊胚形成率低。尤其是臨床妊娠率和累計活產(chǎn)率無法達到讓臨床醫(yī)生和患者接受的水平[19]。

近年來，動物實驗證據(jù)表明褪黑素作為一種抗氧化劑來改善低溫保存動物卵母細胞的發(fā)育能力[9]。褪黑素可以有效清除氧自由基，保護卵膜通透性，保護線粒體功能，抑制卵子凋亡的機制來改善卵子冷凍結局[10-11]?；钚匝酰≧eactive oxygen species，ROS）在冷凍復蘇后卵子中積累對蛋白質、DNA、脂質和細胞膜的損傷，從而破壞卵母細胞結構和功能[12]。最近有報道稱，玻璃化培養(yǎng)基中補充褪黑素可提高玻璃化溫牛卵母細胞和小鼠卵母細胞的質量，通過減少細胞內(nèi)ROS來改善其后續(xù)發(fā)育。有研究者證實褪黑素可以阻止玻璃化處理對AQP基因表達的影響。AQPs基因主要功能是控制細胞內(nèi)水溶質交換的平衡[13-14]。AQP基因表達受損，影響卵膜對水的滲透性，從而形成細胞內(nèi)冰晶。

研究者最近在動物實驗中發(fā)現(xiàn)在卵子冷凍液中添加褪黑素能夠有效地改善卵子冷凍復蘇結局[15]。褪黑素能夠通過其經(jīng)典的抗氧化功能促進非靈長類物種的卵母細胞成熟及早期胚胎發(fā)育，但褪黑素對卵母細胞成熟的其他作用途徑很少受到關注。褪黑素的抗氧化作用能夠幫助提高細胞膜的流動性，降低細胞膜的剛性，從而促進網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞（Clathrin-mediatedendocytosis，CME）[16]。褪黑素是一種色氨酸的衍生物，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素不僅存在于松果體中，也存在于神經(jīng)元細胞、皮膚和卵母細胞中，是一種有效的自由基天然抗氧化劑。先前的研究已經(jīng)證明褪黑素及其代謝物作為自由基的強力直接清除者和間接抗氧化劑調(diào)節(jié)過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶超氧化物歧化酶[17-18]。其機制是褪黑素可以降低卵子因為冷凍復蘇后產(chǎn)生的氧自由基，從而大大提升卵子冷凍復蘇存活率和其后的受精及胚胎發(fā)育潛能[19]。

但是，冷凍液中添加褪黑素的濃度報道不一，尤其是在人類卵子中的應用沒有可靠的數(shù)據(jù)支撐。 因此，在本研究第一階段實驗中，首先明確取得卵子存活率最佳效果褪黑素濃度。本研究設定的三個褪黑素濃度10-7 M、10-9 M、10-11 M中，10-9 M取得了最好的存活率。因此在第二階段實驗中，用褪黑素10-9 M濃度與未添加褪黑素進行復蘇后卵子受精能力比較，發(fā)現(xiàn)添加褪黑素組卵子正常受精率得到明顯改善。

本研究證實卵子冷凍液中添加10-9 M褪黑素能顯著改善卵子存活率和卵子受精能力。本研究的不足之處在于因為倫理問題，采用的卵子是ICSI后未受精卵子，不能進行胚胎發(fā)育潛能的研究，樣本量較小。下一步研究應該進行更大樣本和多中心的臨床研究。

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（收稿日期：2021-07-23）