劉超倫， 劉柱

海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，?？?71158

細菌中通常不存在真核生物類似的mRNA保護機制[1]，形成不具有終止密碼子的mRNA（non-stop mRNA），無法保證mRNA 轉(zhuǎn)錄的精確與完整。不終止mRNA 產(chǎn)生的方式多種多樣，包括過早的轉(zhuǎn)錄終止、核酸酶的切割以及物理損傷等。此外，終止密碼子的通讀[2]、藥物誘導(dǎo)的移碼和密碼子錯配[3]，以及mRNA 轉(zhuǎn)換過程中RNase 的雜散活性[4]，也會導(dǎo)致不終止mRNA 的產(chǎn)生。當(dāng)核糖體遭遇連續(xù)的稀有密碼子[5]、弱的終止密碼子[6]，或者產(chǎn)生問題多肽時[7]，翻譯會在中途發(fā)生停滯，此時RNaseⅡ或多核苷酸磷酸化酶會沿著3'→5'的方向降解mRNA，并在核糖體A位點進行切割[8]，核糖體到達不終止mRNA 的3'端時，mRNA 終止于核糖體的P 位點而A 位點處于空載，翻譯不能繼續(xù)延伸或進入終止階段，導(dǎo)致核糖體滯留在mRNA 上，形成不終止核糖體復(fù)合物（non-stop ribosome complexes）。在大腸桿菌中，不終止核糖體復(fù)合物的產(chǎn)生頻率占新合成肽鏈的2%～4%[9]。該復(fù)合物空耗細胞中的核糖體和tRNA，同時產(chǎn)生截短的、具有細胞毒性的異常多肽，嚴重損害核糖體的循環(huán)、蛋白質(zhì)合成以及細胞的進一步生長和活力[10-11]。

為了回收滯留的核糖體，降解不終止mRNA及其編碼的異常蛋白質(zhì)產(chǎn)物，細菌進化出多種核糖體拯救機制，包括tmRNA 與SmpB 介導(dǎo)反式翻譯，ArfA 與ArfB 介導(dǎo)的拯救機制（alternative ribosome rescue factors，Arfs），以及核糖體質(zhì)量控制（bacterial ribosome quality control，RQC）與肽基tRNA 脫落（peptidyl-tRNA drop-off）等[12-13]。其中，反式翻譯是拯救不終止核糖體復(fù)合物最普遍、最有效的途徑。與其他核糖體拯救機制相比，反式翻譯的優(yōu)勢在于能夠降解異常的多肽與mRNA[14]。在一些生物中，反式翻譯系統(tǒng)是必不可少的[15-17]。反式翻譯由tmRNA（又稱ssrA）及其蛋白伴侶SmpB 組成，在細菌中普遍存在，甚至在一些細胞器中也有發(fā)現(xiàn)[14,18]。tmRNA 自1979 年在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，其結(jié)構(gòu)與功能已逐漸被闡釋清楚。tmRNA 既有tRNA 樣結(jié)構(gòu)域（tRNA-like domain，TLD），又有mRNA 樣結(jié)構(gòu)域（mRNA-like domain,MLD），氨?；痶mRNA 與SmpB 結(jié)合后，在延伸因子EF-Tu 的輔助下與滯留核糖體中空的A 位點結(jié)合，恢復(fù)翻譯并給新生肽添加降解標簽，最終回收滯留的核糖體，并降解不終止mRNA 及其編碼的異常蛋白[19-20]。

1 tmRNA-SmpB 介導(dǎo)反式翻譯系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

1.1 tmRNA的結(jié)構(gòu)

在大腸桿菌中，成熟的363 nt tmRNA 是由457 nt ssrA RNA 前體加工而來。tmRNA 主體為4個假節(jié)（pseudoknot）與MLD 組成的巨大環(huán)狀結(jié)構(gòu)，TLD 通過螺旋H2 結(jié)構(gòu)域與假節(jié)相連。成熟tmRNA 的3'末端與5'末端會形成一個受體臂，具有tRNA 中高度保守的CCA 序列，但只能被丙氨酸氨?；痆19]。受體臂附近還存在類似tRNA 的T臂（T stem-loop）與缺乏莖的D 環(huán)(D-loop)，tmRNA與SmpB 的結(jié)合和功能發(fā)揮需要這兩個環(huán)之間的特定相互作用[21]。此外，T 臂轉(zhuǎn)錄后修飾會使得上述相互作用得到增強[22]。

MLD 中包含了一個短的開放閱讀框，其終止密碼子位于保守的H5 螺旋中。該閱讀框可以編碼一個被ClpXP 識別的降解標簽，通常為10 個殘基[23]。與mRNA 相比，MLD 的閱讀框沒有起始密碼子[24]。在大腸桿菌中標簽肽的序列為“AANDENYALAA”，而在維氏氣單胞菌中則為“ANDENYALAA”，標簽肽末端的 Ala-Ala-coo-是ClpXP 降解的最重要位點[25]。

經(jīng)典 tmRNA 分子包含 4 個假節(jié)，PK1 位于MLD 上游，PK2～PK4 位于下游。在大腸桿菌中，tmRNA 對反式翻譯底物添加標簽主要受PK1 的影響，其他假節(jié)的替換對于tmNRA 的功能影響不大[26]。而當(dāng)PK1 被小而穩(wěn)定的RNA 發(fā)夾替代時，tmRNA 仍然能夠給底物添加標簽，這說明PK1 并不直接參與tmRNA 與核糖體的互作，而是穩(wěn)定了TLD 和 MLD 之間 的構(gòu)象 ，防止 tmRNA 錯 誤折疊[27]。在一些細菌中，存在由兩條RNA 鏈組成的tmRNA（two-piece tmRNAs），其假節(jié)數(shù)量較少但翻譯效率并沒有降低，這說明PK2、PK3 和PK4 的主要作用是tmRNA 的折疊和成熟，而不是參與反式翻譯[28-29]。

1.2 SmpB的結(jié)構(gòu)

SmpB 是反式翻譯必不可少的RNA 伴侶蛋白，在所有細菌中高度保守。SmpB蛋白具有一個寡核苷酸結(jié)合折疊結(jié)構(gòu)（oligonucleotide-binding fold），核心由一個封閉的桶狀結(jié)構(gòu)組成[30]。該桶中有 8 條反向平行的 β 鏈，周圍環(huán)繞著 3 個 α 螺旋，而第64～82 個氨基酸殘基形成了一個中心環(huán)并與鏈β4 和β5 相連。SmpB 結(jié)構(gòu)與已知的與翻譯相關(guān)的RNA 結(jié)合蛋白IF1、核糖體蛋白S17 以及天冬氨酰tRNA 合成酶的N 末端結(jié)構(gòu)域具有相似性[31]。 SmpB 蛋白 Arg-35、Phe-107 和 Val-31 的側(cè)鏈扮演著tRNA 中D 臂的角色，與tmRNA 的TLD 特異性結(jié)合；中心環(huán)則參與了與丙氨酸t(yī)RNA合成酶的相互作用，促進tmRNA 與丙氨酸發(fā)生氨?；磻?yīng)[32]。除了核心結(jié)構(gòu)外，SmpB 蛋白還存在一個獨立的C 末端尾巴，尾巴中富集了側(cè)鏈帶正電荷的賴氨酸與精氨酸殘基。SmpB 的C 末端尾巴在溶液中無序卷曲，在核糖體中卻能形成一個α 螺旋結(jié)構(gòu)；該螺旋可以通過正電荷進入核糖體30S 亞基 mRNA 通道中的 A 位點，幫助 tm-RNA-SmpB 復(fù)合物進入滯留的核糖體并支持肽基轉(zhuǎn)移[33]。

2 tmRNA-SmpB 介導(dǎo)的反式翻譯的分子機制

核糖體長時間的翻譯停滯會使得mRNA在核糖體的A 位點附近發(fā)生核酸內(nèi)切酶內(nèi)切[6]，隨后tmRNA 在丙氨酰-tRNA 合成酶的作用下裝載丙氨酸，并與EF-Tu 和SmpB 蛋白結(jié)合，進入核糖體的A 位點[34]。tmRNA·SmpB·EF-Tu·GTP 四元復(fù)合物中TLD 和SmpB 的構(gòu)象類似于解碼期間的氨?；?tRNA·EF-Tu·GTP 的 A/T 狀態(tài)[35]。SmpB 通過 C末端尾巴的帶電殘基與mRNA 通道互作并將SmpB 固定在A 位點，取代了密碼子-反密碼子相互作用并結(jié)合在核糖體的解碼中心和mRNA通道上。此時tmRNA 的受體臂與正常翻譯過程中?；膖RNA 受體臂類似，PK2 的環(huán)被夾在uS3 的螺旋-轉(zhuǎn)-螺旋基序的口袋中，與核糖體蛋白uS3 互作并將tmRNA 錨定到小亞基；H5 則堵塞mRNA通道的入口并緊靠SmpB 的尾巴，其磷酸酯主鏈與 uS3 的 Arg132 和 Arg143 發(fā)生靜電相互作用[35]。值得注意的是，當(dāng)滯留核糖體復(fù)合物中P 位點下游的核苷酸數(shù)量大于9 時，過長的mRNA 會與核糖體mRNA通道入口的H5發(fā)生碰撞，反式翻譯的效果會顯著降低，這說明PK2和H5與核糖體的結(jié)合可能在滯留核糖體的識別中發(fā)揮作用[35-36]。

進入核糖體之后，tmRNA 很容易從EF-Tu 中釋放出來[20]。肽基轉(zhuǎn)移之前，tmRNA-SmpB 復(fù)合物需要發(fā)生兩個構(gòu)象變化[35]：SmpB 的C 末端尾巴通過高度保守的Gly132 發(fā)生彎曲，允許SmpB 主體進入 A 位點；tmRNA 的 D 環(huán)與 16S rRNA H38 互作，TLD 的3'-CCA 末端進入肽基轉(zhuǎn)移中心（peptidyl transfer center，PTC）。轉(zhuǎn)肽后，新生肽被一個丙氨酸延長, 閱讀框從mRNA 轉(zhuǎn)換到tmRNA 的MLD 上[37]。因而轉(zhuǎn)肽過程中，MLD 必須穿過由16S rRNA H34 與 G530 組成的物理“門閂”，以加載到 mRNA 通道中[35]。此時，SmpB 的 C 末端尾巴保持α 螺旋，而高度保守的Gly132 則再次充當(dāng)SmpB 蛋白主體與尾巴之間的柔性關(guān)節(jié)，促進C 末端尾巴翻轉(zhuǎn)進而與E 位點的mRNA 通道結(jié)合，騰空A位點，并將tmRNA-SmpB 錨定在P位點[35]。由于位于mNRA 通道入口的SmpB 和隸屬于tmRNA的H5 發(fā)生了移動，不再堵塞mNRA 通道的入口，MLD 得以通過 A 位點的“門閂”。MLD 加載到mRNA 通道后，還需要保證MLD 內(nèi)的閱讀框能夠正確定位，確保核糖體終止于閱讀框內(nèi)的終止密碼子。點突變與Cryo-EM 研究表明，MLD 編碼區(qū)第一個密碼子（恢復(fù)密碼子）的前五個核苷酸，對于MLD 與閱讀框在核糖體中的準確定位十分關(guān)鍵[35,38-39]?；謴?fù)密碼子上游區(qū)域能夠與SmpB 蛋白底部的疏水口袋及其C 末端尾巴互作，這些互作將恢復(fù)密碼子直接定位在核糖體30S 解碼中心[40-41]。

Ala-tRNAAla與MLD 上的恢復(fù)密碼子結(jié)合后，EF-G 將肽 基-tRNAAla轉(zhuǎn) 移到 P 位點 ，迫 使 tm-RNA-SmpB 趨向 E 位點；此時 tmRNA-SmpB 復(fù)合物不會模擬結(jié)合在E 位點的tRNA，而是通過E 位點移至核糖體的溶劑側(cè)。這是因為TLD-SmpB 復(fù)合體會與E 位點的核糖體發(fā)生碰撞，而MLD 依舊能夠通過 E 位點由 uS7、uS11 以及 16S rRNA G693組成的“門閂”，并被完全加載到mRNA 通道中[35]。隨后，翻譯將在MLD 的閱讀框上進行，并將標簽肽添加到新生的多肽鏈上，在終止密碼子進入A位點后翻譯終止并進行核糖體回收。

反式翻譯添加到新生多肽上的標簽?zāi)軌虮欢鄠€蛋白酶識別，例如ClpXP、ClpAP 和Lon，它們促進了異常多肽的降解[42-43]。ClpX 采用一種獨特的機制識別tmRNA 的降解標簽，其AAA+環(huán)的軸向通道被A 亞基的pore-2 loop 所封閉，特異性地與tmRNA 標簽肽的C 末端互作[44]。與新生肽降解一致，引起核糖體滯留的不終止mRNA 也會被tm-RNA MLD 的 3'端招募的 3'→5'核酸外切酶RNase R所降解[45]。

3 tmRNA與SmpB以多種方式發(fā)揮功能

反式翻譯在所有已測序的細菌基因組中都是保守的，對于細菌的存活十分重要[17,46]。在一些病原菌中,例如金黃色葡萄球菌、李斯特菌或結(jié)核分枝桿菌，反式翻譯是細胞存活的必須條件[47-49]。而在含有多種核糖體拯救機制的細菌中，反式翻譯的失活帶來的影響千差萬別：有些菌株會產(chǎn)生毒力缺陷[50-53]，有些菌株的耐藥性和抗逆能力會受到影響[54-56]，還有些細菌的細胞周期會發(fā)生改變[57-59]。

反式翻譯的主要功能為翻譯質(zhì)量控制。前文詳細描述了反式翻譯拯救滯留的核糖體的分子機制，反式翻譯最直接的功能是將不終止核糖體復(fù)合物中的核糖體、異常mRNA 及其編碼的異常蛋白在處理后回收，并應(yīng)用于新的翻譯循環(huán)。除此之外，tmRNA 與SmpB 還能夠根據(jù)蛋白質(zhì)折疊與分泌水平介導(dǎo)翻譯質(zhì)量控制。例如，當(dāng)dnaK敲除時，錯誤折疊的新生多肽會成為反式翻譯的靶標并被迅速降解[51]。而當(dāng)SecYEG 介導(dǎo)的共翻譯轉(zhuǎn)運被氯霉素或四環(huán)素抑制導(dǎo)致SecYEG 被堵塞時，反式翻譯通過釋放核糖體恢復(fù)SecYEG 的分泌功能，避免SecY降解[60]。

除了翻譯質(zhì)量控制外，tmRNA 與SmpB 還以反式翻譯的形式參與細菌的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。反式翻譯可以直接調(diào)控某些基因的表達，例如阻遏蛋白LacI。當(dāng)LacI 的濃度過高時，LacI 會結(jié)合在自身基因的3'端從而阻斷自身的轉(zhuǎn)錄，通過產(chǎn)生不終止mRNA 誘導(dǎo)核糖體滯留，從而阻止新的LacI 合成，防止過量的蛋白積累[61]。目前，通過將tmRNA的標簽肽突變?yōu)榭贵w標簽，許多受到反式翻譯調(diào)控的特異性底物已經(jīng)得到了鑒定[62-64]。另一方面，反式翻譯系統(tǒng)還會通過間接的方式參與細菌的應(yīng)激反應(yīng)。例如在饑餓狀態(tài)下，毒素-抗毒素系統(tǒng)的RelE 將會被激活，切割胞內(nèi)的mRNA 從而大量誘導(dǎo)不終止翻譯復(fù)合物的產(chǎn)生，減少細胞能量的消耗以應(yīng)對饑餓；而當(dāng)營養(yǎng)恢復(fù)時，細菌利用反式翻譯系統(tǒng)拯救滯留的核糖體并恢復(fù)生長[65]。MazF 的機制也類似，通過誘導(dǎo)滯留核糖體的產(chǎn)生使得細菌在逆境中更耐受[66]。

值得注意的是，盡管tmRNA 與SmpB 對于反式翻譯來說是缺一不可的，但二者也可能以不依賴于反式翻譯的方式發(fā)揮功能。例如，在金黃色葡萄球菌中tmRNA 可以發(fā)揮sRNA 的功能，與crt-MNmRNA 的RBS 區(qū)發(fā)生堿基配對，調(diào)控金黃色葡萄球菌的色素合成[67]。而在維氏氣單胞菌中，敲除SmpB 與敲除tmRNA 在轉(zhuǎn)錄和代謝水平上的差異也間接證明二者可能具有獨立作用[68]。遺憾的是，作為RNA 伴侶蛋白的SmpB 目前還尚未被報道具有不依賴反式翻譯的功能。

4 展望

經(jīng)過數(shù)十年的研究，反式翻譯模型已經(jīng)基本建立，關(guān)于反式翻譯識別和回收不終止核糖體復(fù)合物的分子機制已有足夠的闡述，為反式翻譯的應(yīng)用提供了扎實的理論基礎(chǔ)。基于對反式翻譯機制的深刻理解，開發(fā)以反式翻譯為基礎(chǔ)，調(diào)控細菌蛋白水平的分子生物學(xué)工具是反式翻譯應(yīng)用的重要方向。在研究基因功能與細菌代謝通路的過程中，無論是通過誘導(dǎo)型啟動子或sRNA 等方式來控制基因的轉(zhuǎn)錄水平，還是通過核糖體開關(guān)或mRNA 降解對基因進行翻譯水平上的調(diào)控，均只能阻止基因表達合成新的蛋白，而對已經(jīng)合成的蛋白無能為力。對于穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可能需要多輪復(fù)制才能將其在胞內(nèi)的數(shù)量和活性降低到足夠低的水平，而在此期間可能會大大影響基因表達調(diào)控的有效性。因此，將能夠降解特定帶標簽蛋白的反式翻譯系統(tǒng)開發(fā)成新的分子生物學(xué)工具，具有難以替代的重要意義。近年來，人們已經(jīng)在細菌中應(yīng)用了一些基于反式翻譯系統(tǒng)的遺傳工具。Mc Ginness 等[69]將 tmRNA 標簽的最后 3 個殘基LAA突變?yōu)镈AS并插入了4個額外的氨基酸殘基，使得ClpXP 只有在SspB 存在的情況下才能對標記底物進行徹底降解。該系統(tǒng)已經(jīng)被成功應(yīng)用于大腸桿菌、芽孢桿菌與分歧桿菌之中，并且進行了進一步改進以確保降解的精確與徹底[70-73]。然而，上述系統(tǒng)依賴于SspB與大腸桿菌的tmRNA標簽序列，限制了其在不同細菌中的應(yīng)用。如何提高反式翻譯系統(tǒng)作為遺傳工具的使用范圍并探究其中的具體機制，將是后續(xù)研究需要解決的主要問題。

由于反式翻譯在細菌中普遍存在并且起關(guān)鍵作用，反式翻譯抑制劑有極大可能是有效的廣譜抗生素；此外，由于在動物中沒有發(fā)現(xiàn)反式翻譯途徑，反式翻譯抑制劑將不會對宿主帶來副作用。因而，反式翻譯日漸成為了抗生素開發(fā)的重要靶標。反式翻譯抑制劑KKL-35 的發(fā)現(xiàn)證明了上述觀點：在反式翻譯中阻礙tmRNA 給新生肽添加降解標簽的KKL-35，在抑菌實驗中展現(xiàn)了廣譜抗菌活性，能夠殺死結(jié)核分枝桿菌并有效抑制弗氏志賀菌和炭疽芽孢桿菌的生長[74]。后續(xù)KKL-2098、KKL-40、KKL-55、吡嗪酰胺（PZA）等反式翻譯抑制劑的研究證實反式翻譯在醫(yī)療領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用潛力[75-78]。在全球范圍細菌耐藥性不斷增加、超級細菌不斷產(chǎn)生的大環(huán)境下，反式翻譯應(yīng)被視為未來進一步開發(fā)抗生素的主要靶標。