王竹,余善君,吉林佳,李詠婷,楊傳雄,黃燕妮

海南醫(yī)學(xué)院, 教育部熱帶病重點實驗室, ?？?571199

多糖作為重要的生物活性物質(zhì)，已被證實具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性，在醫(yī)藥、食品、保健品及化妝品等諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]。海洋微生物由于生活在高鹽、寡營養(yǎng)、低溫等極端環(huán)境中，能夠產(chǎn)生比陸生生物活性更獨特的多糖類化合物。Kokoulin等[3]發(fā)現(xiàn)居海嗜冷桿菌的莢膜多糖可抑制白血病細胞增殖；Durairajan等[4]發(fā)現(xiàn)海洋來源的殼聚糖可抑制尿路感染致病性大腸桿菌的群體感應(yīng)能力，抑制生物膜的形成，為無抗生素治療尿路感染提供了可能。研究發(fā)現(xiàn)海洋多糖尤其是微生物來源的胞外多糖多為含一定比例半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等的雜多糖，不僅結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且活性獨特，已成為多糖類活性物質(zhì)的重要來源[5]。

淡紫擬青霉菌(Paecilomyceslilacinus)屬于半知菌綱(Deuteromycetes)絲孢菌目(Cnidosporales)的擬青霉屬(Paecilomyces)，為土壤習(xí)居菌，具有較高的藥用和環(huán)境保護價值。最佳生長條件為15～30 ℃、pH 6～9的黑暗環(huán)境或黑暗與光照交替的環(huán)境[6]。其分泌的毒素、蛋白酶、多糖等次級代謝產(chǎn)物具有殺蟲、抑菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降解重金屬及農(nóng)藥殘留等功能，為目前極具推廣潛力的生防菌及功能菌[7-11]。史懷等[6]對淡紫擬青霉胞外多糖EP-1進行了結(jié)構(gòu)研究，發(fā)現(xiàn)其是以β-(1,3)糖苷鍵連接而成的無分枝葡聚糖，對尖孢鐮刀菌具有很好的抑制作用。紅樹林淡紫擬青霉由于長期生活在極端海洋環(huán)境中，具有產(chǎn)生獨特活性次級代謝產(chǎn)物的潛力。本課題組前期從海南沿海紅樹林中分離鑒定了一株淡紫擬青霉，其產(chǎn)生的胞外多糖具有一定的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，體外實驗發(fā)現(xiàn)其可抑制HSV-1的吸附和生物合成，并刺激抗病毒免疫[12-14]。但胞外多糖的提取易受多種因素的影響，提取條件不當會對多糖的提取率有較大影響，如乙醇沉淀法提取多糖過程中易受發(fā)酵液超濾濃縮倍數(shù)、三氯乙酸終濃度、乙醇終濃度等提取條件的影響[15-16]。為探討該淡紫擬青霉胞外多糖的最佳提取方案，本研究擬通過改變醇沉法提取過程中發(fā)酵液的超濾濃縮倍數(shù)、乙醇終濃度、沉淀時間和溫度、三氯乙酸終濃度等影響多糖提取率及蛋白脫除率的常見因素，觀察提取效果，以建立可靠、穩(wěn)定的胞外多糖提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 改良馬丁培養(yǎng)基和改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基購于廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；95%濃硫酸(分析純，批號：20120301-1) 購于廣州化學(xué)試劑廠；100%三氯乙酸(分析純，批號:2015032)購于天津市福晨化學(xué)試劑廠；95%乙醇(批號:150116)、苯酚(分析純，批號：150116)、葡萄糖(分析純，批號:1707241)購于西隴科學(xué)股份有限公司；3.5 kD透析袋購于華美生物工程公司；總蛋白(TP)測定試劑盒購于長春匯力生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-200H)購于上海智城分析儀器制造有限公司；電子天平(PL203)購于梅特勒-托利多儀器上海有限公司；離心機(Eppendorf 5810ZH061219)購于艾本德(上海)國際貿(mào)易有限公司；生物安全柜(SG403A-HE)購于Baker公司；CO2培養(yǎng)箱(MCO-18AC)購于松下電器有限公司；紫外可見光分光光度計(T6)購于北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1淡紫擬青霉菌發(fā)酵培養(yǎng) 淡紫擬青霉傳代后接種于陳海水配制的馬丁液體培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r·min-1恒溫振蕩發(fā)酵培養(yǎng)一周。3 000 r·min-1，離心15 min，取上清液備用。

1.2.2葡萄糖標準曲線繪制 苯酚-硫酸法測定糖含量[17]，繪制標準曲線。方法如下：精確稱取105 ℃干燥恒重的標準葡萄糖1 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，稀釋10倍，制備葡萄糖標準品溶液，每0.1 mL中含葡萄糖10 mg。準確吸取標準品液10、20、30、40、50、60 μL分置于具塞試管內(nèi)，加蒸餾水至體積0.5 mL，加入5%苯酚0.2 mL，濃硫酸1.25 mL，混勻。置沸水浴中加熱5 min后，迅速冷卻至室溫。蒸餾水調(diào)零，于490 nm波長處測定各標準品液的吸收度，以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.3發(fā)酵上清液濃縮倍數(shù)對多糖提取率的影響 等體積發(fā)酵液分裝到5個錐形瓶中，除一瓶外其余分別濃縮至原體積的1/2、1/3、1/4、1/5，分別加入等體積95% 冰乙醇，置4 ℃、24 h后13 000 r·min-1，4 ℃，離心45 min，沉淀用50% 乙醇洗滌2次后裝入透析袋內(nèi) (截留分子量3.5 kD)，去離子水透析3 d, 每8 h換1次水, 苯酚-硫酸法測多糖含量，計算提取率，以確定多糖提取時的最佳超濾濃度倍數(shù)。實驗重復(fù)3次。多糖提取率(%)=沉淀粗多糖含量/(原發(fā)酵液體積×發(fā)酵液多糖含量)。

1.2.4三氯乙酸終濃度對蛋白脫除率的影響

在等體積發(fā)酵液中加入三氯乙酸至終濃度為 2%、4%、6%、8%、10%，4 ℃放置 24 h，離心取上清, 等體積定容，總蛋白測定試劑盒分別測定上清和發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量，計算蛋白脫除率。蛋白脫除率(%)=(發(fā)酵液中蛋白含量-離心上清液中蛋白含量)/發(fā)酵液中蛋白含量×100%。

1.2.5乙醇終濃度對多糖提取率的影響 于發(fā)酵液中分別加入等體積、2、3、4和5倍體積的95% 冰乙醇，置4℃ 沉淀24 h，離心棄上清，50% 乙醇洗滌沉淀2次后裝入透析袋內(nèi)透析，苯酚-硫酸法測多糖含量，方法同1.2.3，計算提取率。實驗重復(fù)3次。

1.2.6沉淀溫度對多糖提取率的影響 發(fā)酵液中加入等體積95% 的冰乙醇，分別置于4、8、16、25和37 ℃ 沉淀 24 h，離心后用50%的乙醇洗滌沉淀2次，透析和多糖含量檢測同1.2.3。實驗重復(fù)3次。

1.2.7沉淀時間對多糖提取率的影響 取等體積95% 冰乙醇加入發(fā)酵液中，置4 ℃分別沉淀12、16、20、24和28 h，離心，沉淀用50% 的乙醇洗滌2次，透析和多糖含量檢測方法同1.2.3。實驗重復(fù)3次。

1.2.8多糖提取率的正交試驗 以95%乙醇濃度(體積分數(shù))、沉淀溫度、沉淀時間為影響因素, 以多糖提取率為指標, 設(shè)計L9(34)正交試驗，確定乙醇沉淀法最適提取條件, 試驗因素水平見表1。每個處理3個重復(fù)，計算多糖提取率，取其平均值。并對正交試驗獲得的最佳提取條件進行驗證。

表1 L9(34)正交試驗因素水平Table 1 Factor levels of L9(34) orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

以吸光度為縱坐標，葡萄糖濃度為橫坐標繪制標準曲線，結(jié)果見圖1，得y=11.789x-0.190，R2=0.970，線性關(guān)系良好。

2.2 發(fā)酵液濃縮倍數(shù)對多糖提取率的影響

將等體積發(fā)酵液濃縮后再提取多糖，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液濃縮倍數(shù)對多糖提取率有較大影響，結(jié)果見圖2，原體積發(fā)酵液多糖提取率最低，為40.295%±3.915%，濃縮2倍后多糖提取率升至48.915%±2.761%，濃縮3、4和5倍時提取率明顯升高，分別為56.191%±2.338%、57.903%±2.742%、56.849%±2.181%，發(fā)酵液濃縮4倍時多糖提取率最高，與原體積和濃縮1倍時的多糖提取率相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而發(fā)酵液濃縮3、4和5倍時多糖提取率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，因此選擇3倍濃縮倍數(shù)作為多糖提取的發(fā)酵液濃縮倍數(shù)。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

圖2 發(fā)酵液濃縮倍數(shù)對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of concentrated ratio of fermentation liquor on the polysaccharides extraction

2.3 三氯乙酸終濃度對蛋白脫除率的影響

在等體積發(fā)酵液中加入三氯乙酸至終濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，觀察不同濃度三氯乙酸對蛋白脫除率的影響，結(jié)果見圖3。隨著三氯乙酸終濃度增加，蛋白脫除率亦逐漸增加，終濃度10% 時蛋白脫除率達到高峰，為80.946%±2.966%，與終濃度 2%、4%、6% 時相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與終濃度8%時相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此選擇10%的三氯乙酸濃度作為多糖提取的三氯乙酸濃度。

圖3 三氯乙酸終濃度對蛋白脫除率的影響Fig.3 Effect of concentration of trichloroacetic acid on removal rate of proteins from fermentation supernatant

2.4 乙醇用量對多糖提取率的影響

發(fā)酵液中的多糖分別用等體積、2、3、4和5倍體積95%的冰乙醇沉淀24 h，離心后洗滌、透析，苯酚-硫酸法測多糖含量，其收率分別為 46.673%±1.559%、51.130%±2.441%、58.150%±1.847%、59.271%±2.353%和60.363%±2.278%，可見5倍體積95%乙醇對多糖的沉淀效果最好，與等體積和2 倍體積相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但與3、4倍體積相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且等體積與2倍體積乙醇相比，3倍體積與4倍體積乙醇相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖4)，因此選擇3倍體積乙醇為多糖提取的乙醇終濃度。

圖4 乙醇濃度對多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the polysaccharides extraction

2.5 沉淀溫度對多糖提取率的影響

等體積95% 冰乙醇分別于4、8、16、25和37 ℃沉淀發(fā)酵液中的多糖，發(fā)現(xiàn)隨著沉淀溫度的升高，多糖的收率逐漸降低(圖5)，4 ℃ 時糖的收率最高，為46.336%±1.761%，8 ℃ 時為45.846%±1.409%，但二者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；沉淀溫度為16、25和37 ℃ 時糖的收率分別為42.502%±1.604%、41.970%±1.265%和40.924%±1.605%，三者之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與沉淀溫度4和8 ℃ 時相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此選擇4 ℃為多糖提取的沉淀溫度。

2.6 沉淀時間對多糖提取率的影響

發(fā)酵液中加入等體積95% 冰乙醇后置4 ℃分別沉淀12、16、20、24和28 h，多糖的提取率分別為29.260%±1.570%、31.071%±1.733%、39.521%±2.219%、45.593%±1.953%和47.063%±1.518%，可見隨著沉淀時間的延長，多糖的提取率逐漸升高(圖6)，沉淀12 h多糖的提取率與16 h相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而沉淀12與16 h多糖的提取率與20、24和28 h相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；沉淀20與24和28 h相比差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而沉淀24 與28 h相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此選擇24 h為多糖提取的最佳沉淀時間。

圖5 沉淀溫度對多糖提取率的影響Fig.5 Effect of precipitation temperature on the polysaccharides extraction

圖6 沉淀時間對多糖提取率的影響Fig.6 Effect of precipitation time on the polysaccharides extraction

2.7 多糖提取的正交試驗

以95% 乙醇終濃度(體積分數(shù))、沉淀溫度、沉淀時間為影響因素，設(shè)計L9(34)正交試驗，由表2可知影響多糖提取的因素依次為沉淀時間、乙醇濃度和沉淀溫度，即A>C>B，最優(yōu)方案為A3B1C3，即3倍95% 乙醇、4 ℃ 沉淀24 h可獲得該多糖的最佳提取率。經(jīng)方差分析可知A、B、C各因素對多糖的提取均有顯著影響(P<0.05)(表3)。

表2 L9(34) 正交試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Results of L9 (34) orthogonal test

表3 L9(34) 正交試驗方差分析Table 3 Results of L9 (34) analysis of variance

2.8 正交試驗的驗證試驗

根據(jù)正交試驗確定的最佳提取條件A3B1C3進行試驗驗證, 即3倍95%乙醇、4℃沉淀24 h，多糖提取率為57.835%±1.206%。

3 討論

微生物的胞外多糖由于具有產(chǎn)量大、易與菌體分離、生物活性多樣等特征而備受關(guān)注。但多糖的提取易受多種因素影響，如醇沉法的提取溫度、時間、發(fā)酵液濃縮倍數(shù)、乙醇濃度等均可影響多糖的提取率[15]。本研究采用經(jīng)典的乙醇沉淀法提取紅樹林淡紫擬青霉菌的胞外多糖，通過改變發(fā)酵液濃縮倍數(shù)、提取溫度、沉淀時間、乙醇終濃度等，觀察提取效果，以期獲得該多糖醇沉法的最佳提取條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖提取率隨發(fā)酵液濃縮倍數(shù)的增加而增加，發(fā)酵液濃縮4倍時糖的收率最高，達57.903%±2.742%，與原體積和濃縮1倍時相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而發(fā)酵液濃縮3、4和5倍時多糖提取率無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，說明發(fā)酵液濃縮至一定程度后再增加濃縮倍數(shù)并不能提高多糖的提取率。為探討三氯乙酸終濃度對蛋白脫除率的影響，于等體積發(fā)酵液中加入三氯乙酸至終濃度分別為2%、4%、6%、8%、10%，發(fā)現(xiàn)蛋白脫除率隨三氯乙酸終濃度增加而逐漸增加，終濃度10%時蛋白脫除率最高，為80.946%±2.966%，與終濃度2%、4%、6% 時相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而與終濃度 8% 時相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，為盡量減少三氯乙酸對多糖提取率的影響，可選擇8%作為最佳蛋白去除濃度。

本研究還發(fā)現(xiàn)乙醇終濃度、沉淀溫度和時間均對多糖的提取率有顯著影響，4 ℃、24 h沉淀多糖時，隨著乙醇用量的增加多糖提取率亦逐漸增加，3、4和5倍體積95%乙醇對多糖的沉淀效果明顯好于1倍和2倍體積(P<0.05)，而3倍、4倍和5倍體積乙醇對多糖的沉淀無明顯差異(P>0.05)，說明乙醇用量增加到一定程度之后多糖的提取率并不會隨著乙醇濃度的增加而增加；同時發(fā)現(xiàn)等體積乙醇沉淀多糖時，隨著沉淀溫度的升高，多糖的提取率逐漸降低，4和8 ℃ 的沉淀效果相似且明顯優(yōu)于16、25和37 ℃(P<0.05)，而16、25和37 ℃時多糖的沉淀效果無明顯差異(P>0.05)，說明超過一定沉淀溫度之后，多糖的提取率反而會下降。另外，等體積冰乙醇4 ℃ 沉淀多糖時隨著沉淀時間的延長，多糖的提取率逐漸增高，沉淀28 h時多糖的提取率達47.063%±1.518%，明顯高于12、16和20 h 的多糖提取率(P<0.05)，但沉淀24與28 h相比多糖的提取率無明顯差異(P>0.05)，說明達到一定的沉淀時間后多糖的提取率并不會繼續(xù)增加。

為進一步探討乙醇濃度、沉淀時間和沉淀溫度對多糖提取的交互影響，根據(jù)此3個單因素試驗對多糖提取的影響、提取的便利性以及多糖的質(zhì)量等多方面考慮，我們選取了部分影響較大的因素水平設(shè)計了L9(34)正交試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響多糖提取效果的因素依次為95% 乙醇用量、沉淀時間和沉淀溫度，最優(yōu)方案為3倍95% 乙醇、4 ℃ 沉淀24 h即可獲得該多糖的最佳提取率，且經(jīng)方差分析發(fā)現(xiàn)各因素對多糖的提取均有顯著影響(P<0.05)。因此，后續(xù)試驗可參考本實驗的結(jié)果選擇最優(yōu)提取方案。