王珊珊,毋少宇,劉一超,戰(zhàn)崳華,柯秀彬,陸偉,燕永亮

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081

PⅡ蛋白廣泛分布于古細(xì)菌、細(xì)菌和高等植物中，是較為古老的蛋白家族之一[1]。長期以來，PⅡ蛋白GlnB、GlnK被認(rèn)為是氮代謝系統(tǒng)的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，通過感知并傳遞細(xì)胞內(nèi)的碳氮代謝信號，級聯(lián)調(diào)控glnKamtB、nifLA和nifHDK等固氮相關(guān)基因表達(dá)[2-3]。谷氨酰胺是氨同化的主要產(chǎn)物，也是細(xì)胞內(nèi)氮狀態(tài)的主要指標(biāo)。PⅡ蛋白在固氮網(wǎng)絡(luò)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，一方面由谷氨酰胺濃度介導(dǎo)，另一方面還受碳信號α-酮戊二酸濃度的影響，二者都可以改變PⅡ蛋白的構(gòu)象，影響其與相應(yīng)蛋白靶標(biāo)的結(jié)合，最終達(dá)到級聯(lián)調(diào)控固氮網(wǎng)絡(luò)的作用[4-5]。細(xì)胞內(nèi)α-酮戊二酸的濃度不僅表示細(xì)胞的碳狀態(tài)，還可以衡量細(xì)胞的氮可用性，在碳氮代謝平衡中發(fā)揮重要的作用[6-7]。PⅡ蛋白可以與α-酮戊二酸結(jié)合，每個蛋白含有3個α-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)，不同細(xì)胞狀態(tài)的PⅡ蛋白結(jié)合α-酮戊二酸數(shù)量不同，具有α-酮戊二酸傳感器的功能。在PⅡ蛋白穩(wěn)定的三聚體內(nèi)，具有序列保守、結(jié)構(gòu)靈活的T環(huán)、B環(huán)與C環(huán)，三環(huán)之間可以形成亞基間的裂縫，構(gòu)成了蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的位點(diǎn)[8]。α-酮戊二酸主要結(jié)合于相鄰亞基之間的外側(cè)裂隙中，一般需要二價陽離子(如Mg2+)的參與。

施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)A1501是γ變形桿菌中的聯(lián)合固氮菌，固氮過程受到嚴(yán)格的調(diào)控，大多數(shù)細(xì)菌中含有GlnB與GlnK 2種PⅡ蛋白，但在該菌中僅存在唯一的PⅡ蛋白GlnK，編碼該蛋白的glnK基因突變后，固氮酶活完全喪失，表明該蛋白在固氮調(diào)控中具有十分重要的作用[9]。但是A1501菌中GlnK蛋白與信號分子互作機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究。本研究通過異源表達(dá)GlnK蛋白并采用微量熱涌動技術(shù)體外檢測了GlnK及突變蛋白與碳信號分子α-酮戊二酸的互作，以期了解A1501中碳信號分子α-酮戊二酸與關(guān)鍵調(diào)控蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)一步解析固氮菌的碳氮代謝偶聯(lián)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及培養(yǎng)條件

施氏假單胞菌A1501、原核表達(dá)載體pET28a為本實(shí)驗(yàn)室保存；高頻轉(zhuǎn)化受體菌株Top10、BL21(DE3)購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司。大腸桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基(0.5%酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉及蒸餾水)，37 ℃培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及細(xì)菌DNA提取試劑盒購自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；無縫克隆試劑盒購自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司；普通Taq酶GreenTaqMix及高保真DNA聚合酶Phanta購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；內(nèi)切酶購自美國NEB公司；His Pur Ni-NiA瓊脂糖樹脂購自賽默飛世爾；TGX Stain-Free丙烯酰胺免染制膠試劑盒購自美國Bio-Rad公司；α-酮戊二酸標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；蛋白標(biāo)記試劑盒、優(yōu)化毛細(xì)管均購自德國Nano Temper公司；實(shí)驗(yàn)涉及到的引物合成及測序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

Eppendorf 5424低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；HITACHI U-3010紫外分光光度計(jì)(日本HITACHI公司)；Branson Digital SFX550超聲波破碎儀(美國Branson公司)；Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Bio-Rad Mini-Protean 3 Electrophoresis System蛋白質(zhì)電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Bio-Rad GeneAmp PCR System 9700 PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Biotek Cytation 5細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)(美國Biotek公司)；Nano Temper Monolith NT.115微量熱泳動儀(德國Nano Temper公司)。

1.3 GlnK蛋白的生物信息學(xué)分析

從Uniprot(www.uniprot.org)獲得施氏假單胞菌A1501中g(shù)lnK基因序列和GlnK蛋白的氨基酸序列及蛋白質(zhì)分子量大小，利用NCBI和軟件DNAMAN、MEGA7進(jìn)行多序列比對、同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建；利用Swiss modle(https://swissmodel.expasy.org)進(jìn)行GlnK蛋白同源建模，利用VMD軟件進(jìn)行特定氨基酸顯示。

1.4 GlnK、GlnK-G89A蛋白表達(dá)重組載體的構(gòu)建

本研究以pET28a為目的載體，通過同源重組原理設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的片段的引物，利用無縫克隆試劑盒將目的片段與pET28a載體相連，最終通過大腸桿菌BL21(DE3)外源表達(dá)GlnK與GlnK-G89A蛋白。具體構(gòu)建過程如下：選擇pET28a載體的BamHⅠ和NdeⅠ作為glnK基因與GlnK蛋白G89位點(diǎn)突變?yōu)楸彼?Ala，A)的基因glnK-G89A的插入位點(diǎn)，根據(jù)同源重組原理設(shè)計(jì)相關(guān)基因引物(表1)。GlnK蛋白的G89位點(diǎn)所對應(yīng)的堿基序列為基因的第265～267位的GGC，為了獲得glnK-G89A基因片段，需將該位點(diǎn)突變?yōu)锳，該氨基酸的密碼子有GCU、GCC、GCA、GCG，在A1501的glnk序列中GCC較多，因此本研究選擇將原堿基序列GGC突變成GCC。將含有突變位點(diǎn)的glnK基因片段前部分命名為glnk-G89A-1基因，含有突變位點(diǎn)的glnK基因片段后部分命名為glnk-G89A-2基因。利用引物GlnK-G89A-F1與GlnK-G89A-R1擴(kuò)增glnk-G89A-1基因，利用引物GlnK-G89A-F2與GlnK-G89A-R2擴(kuò)增glnk-G89A-2基因，最終通過引物GlnK-G89A-F1與GlnK-G89A-R2融合PCR得到含有突變位點(diǎn)的整個基因片段。單片段PCR反應(yīng)體系(共50 μL)：含50～100 ng的A1501基因組1 μL，上、下游引物各1 μL，高保真DNA聚合酶25 μL，ddH2O 22 μL。融合PCR反應(yīng)體系(共50 μL)：擴(kuò)增得到的glnK-G89A-1和glnK-G89A-2基因產(chǎn)物各1 μL，上、下游引物各1 μL，高保真DNA聚合酶25 μL，ddH2O 22 μL。載體構(gòu)建中涉及的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min ；95 ℃ 變性30 s，55 ℃退火30 s(所有基因片段，包括融合PCR,退火溫度與時間相同)，72 ℃延伸 3 min，30個循環(huán) ；72 ℃終延伸5 min。載體與目的基因片段連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10中獲得克隆重組載體，測序成功后，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)獲得GlnK、GlnK-G89A蛋白表達(dá)菌株。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物列表Table 1 PCR primers used in this work

1.5 GlnK、GlnK-G89A蛋白誘導(dǎo)表達(dá)純化

將37 ℃過夜培養(yǎng)的含有GlnK、GlnK-G89A蛋白表達(dá)載體的大腸桿菌按1%的接種量接種至含50 μg·mL-1卡那霉素(kanamycin，Km)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.8左右，加入IPTG使其終濃度為0.1 mmol·L-1，16 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)15 h，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。5 000 r·min-1離心10 min收集菌體，加入1/20體積NTA Buffer(300 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1NaH2PO4，pH 7.5)重懸菌體，超聲破碎細(xì)胞(超聲波破碎儀工作程序：工作3 s，間隔5 s，功率為30%，工作時長為10 min)，12 000 r·min-1、45 min離心收集上清。分別使用鎳柱親和層析純化GlnK與GlnK-G89A蛋白，使用不同咪唑濃度(10、20、60、80 和200 mmol·L-1)的NTA緩沖液梯度洗脫，EP管分別收集各梯度洗脫液，SDS-PAGE電泳檢測蛋白純化情況，確定最終洗脫濃度，大量收集GlnK、GlnK-G89A融合蛋白，采用Brandford法測定蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 GlnK、GlnK-G89A與碳信號分子α-酮戊二酸的互作分析

利用蛋白標(biāo)記試劑盒進(jìn)行標(biāo)記已經(jīng)純化的GlnK、GlnK-G89A蛋白，首先利用試劑盒中的Labeling Buffer置換掉目的蛋白所處的緩沖液環(huán)境，利用細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)測定Labeling Buffer中目的蛋白的濃度，利用公式C(μmol·L-1)=蛋白(mg·mL-1)×103/分子量(kD)計(jì)算交換完Buffer的目的蛋白的濃度；根據(jù)試劑盒熒光標(biāo)記體系標(biāo)記各蛋白。利用微量熱泳動(microscale thermophoresis，MST)儀器的Pretest模塊檢測蛋白的熒光標(biāo)記效率，檢測合適后進(jìn)行蛋白與α-酮戊二酸互作體系準(zhǔn)備。準(zhǔn)備16個PCR小管，1～16進(jìn)行標(biāo)號，向各管中加入10 μL MST Buffer，取10 μL用蒸餾水稀釋好的α-酮戊二酸(pH 7.8)加入1號小管中，吸吹混勻30次，再取10 μL 1號管中混好的液體加入2號管中，吸吹混勻30次，依次2倍梯度稀釋配體，最后一管吸吹混勻完畢后吸取10 μL混合液丟棄。依次向稀釋好的各PCR管中加入10 μL標(biāo)記好的且熒光檢測合格的目的蛋白，吸吹混勻30次。向1～16號小管中放入毛細(xì)管將反應(yīng)體系吸入其中。將吸滿液體的1～16號毛細(xì)管依次放置于檢測板，最終將檢測板放入MST儀器中進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 GlnK蛋白的生物信息學(xué)分析

A1501中g(shù)lnK基因全長339 bp，編碼蛋白含有112個氨基酸，預(yù)測分子量為12.286 kD。為了分析A1501中GlnK蛋白與其他不同屬菌株蛋白的親源關(guān)系，采用Blastp程序以A1501的GlnK氨基酸序列，與NCBI的UniProtKB/Swiss-Prot(swissport)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了序列比對，選擇序列一致性高于70%的13個來自不同屬菌株的蛋白序列進(jìn)行了進(jìn)化分析，利用MEGA7軟件的非加權(quán)組平均(UPGMA)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，選擇步長檢驗(yàn)方法(Bootstrap method)對構(gòu)建好的進(jìn)化樹進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)置為500次。建樹結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，A1501中GlnK蛋白與模式固氮菌棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的親源關(guān)系最近，序列一致性可達(dá)96.43%，其次為大腸桿菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，序列一致性分別為78.57%和76.79%，表明A1501中GlnK蛋白與棕色固氮菌中同源蛋白在各自體內(nèi)發(fā)揮的功能可能最為相似。

利用軟件MEGA7中的Clustal W對GlnK蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建過程中涉及的不同屬菌株的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，結(jié)果如圖2所示，A1501中GlnK蛋白與其他12個不同屬菌株中的同源蛋白相似，都具有較多的保守位點(diǎn)。在該蛋白中也包含PⅡ蛋白最保守的TGxxGDGKI基序，大腸桿菌點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明第89位點(diǎn)甘氨酸(Gly，G)的突變會使PⅡ蛋白在任何條件下都無法與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸結(jié)合，而該位點(diǎn)位于該基序的第7位，這表明了G89位點(diǎn)可能在PⅡ蛋白與α-酮戊二酸結(jié)合的過程中具有十分重要的作用。

為了進(jìn)一步的了解G89位點(diǎn)在A1501的GlnK蛋白空間結(jié)構(gòu)中所處的位置，利用Swiss-model在線建模服務(wù)器(https://swissmodel.expasy.org)的簡捷模式(automatic mode)對GlnK蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，將編碼GlnK蛋白的氨基酸序列通過網(wǎng)頁提交，服務(wù)器自動在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)中為目標(biāo)序列尋找已知結(jié)構(gòu)的同源蛋白，并以此作為模板，為A1501的GlnK蛋白建立結(jié)構(gòu)模型，預(yù)測得到了多個GlnK蛋白同源模型且均完全覆蓋該蛋白的所有氨基酸序列。選擇與GlnK蛋白序列相似性最高的1glnk.2.A(存在于大腸桿菌)為建模模板，二者序列一致性可達(dá)78.8%，可信性較高。建模結(jié)果利用VMD蛋白結(jié)構(gòu)可視化軟件重新顯示后如圖3所示，此結(jié)構(gòu)表明A1501的GlnK為同源三聚體結(jié)構(gòu)，由多個α螺旋、β折疊和環(huán)狀結(jié)構(gòu)所組成，與已經(jīng)報道的PⅡ蛋白的結(jié)構(gòu)相似。α-酮戊二酸可以與PⅡ蛋白結(jié)合，一般結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白環(huán)與環(huán)形成的裂縫中。在同源建模所得的GlnK蛋白三維結(jié)構(gòu)可知，G89位于一個β折疊之上，較接近于環(huán)狀區(qū)域?？赡芘c環(huán)與環(huán)之間含有的由共價鍵形成的α-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)，此處氨基酸的改變可能會影響原有蛋白與α-酮戊二酸的共價結(jié)合。

圖1 系統(tǒng)發(fā)育分析GlnK同源蛋白在不同物種中的遺傳與進(jìn)化距離Fig.1 Phylogenomic analysis depicting the genetic and evolutionary distances of GlnK homologous proteins in different species

注：紅色框標(biāo)記序列為GlnK蛋白最保守基TGxxGDGKI，黑色框標(biāo)記為G89。圖2 利用CLUSTAL W對不同物種中GlnK同源蛋白的序列比對Fig.2 CLUSTAL W alignment of GlnK homologous proteins from different species

注：紅色球棍為保守的GLY89。圖3 側(cè)面觀察GlnK的晶體結(jié)構(gòu)Fig.3 The crystal structure of GlnK viewed from the side

2.2 GlnK、GlnK-G89A蛋白的表達(dá)與純化

為了體外得到GlnK與GlnK-G89A蛋白，構(gòu)建了重組載體pET28a-glnk及pET28a-glnk-G89A，轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21(DE3)后PCR結(jié)果驗(yàn)證如圖4、圖5所示。PCR擴(kuò)增片段與各目的基因片段大小一致，經(jīng)測序比對為含有特定的glnK基因片段，表明表達(dá)GlnK、GlnK-G89A蛋白的菌株構(gòu)建成功。隨后對GlnK及GlnK-G89A蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)純化，分別以未誘導(dǎo)的含有pET28a-glnK及pET28a-glnk-G89A重組載體的表達(dá)菌體為對照。SDS-PAGE凝膠電泳發(fā)現(xiàn)二者只有在200 mmol·L-1咪唑洗脫時分別在標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的10～15 kDa處有一蛋白條帶，與GlnK蛋白的分子量12.286 kDa大小較為符合，為目的條帶，表明GlnK、GlnK-G89A蛋白在含有200 mmol·L-1咪唑的NTA緩沖液中被洗脫下來，并且洗脫后電泳背景清晰，沒有其他的蛋白質(zhì)條帶，如圖6、7所示，表明分離后的目的蛋白純度較高。

注：M—Trans2K PlusⅡ DNA Marker，1～2—全長glnk基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4 重組載體pET28a-glnk PCR驗(yàn)證Fig.4 Verification of recombinant pET28a-glnk prokaryotic expression vector

2.3 GlnK及GlnK-G89A蛋白與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸的體外互作

利用MST對GlnK、GlnK-G89A蛋白與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸的體外互作進(jìn)行探索，2個蛋白在MST Buffer存在下，利用優(yōu)化毛細(xì)管進(jìn)行互作實(shí)驗(yàn)效果最好，不易發(fā)生吸附、聚集現(xiàn)象，可能是由于GlnK、GlnK-G89A蛋白的特殊生理特性所造成的。GlnK、GlnK-G89A蛋白與α-酮戊二酸MST互作結(jié)果如圖8所示，當(dāng)反應(yīng)體系中GlnK蛋白濃度為1.55 μmol·L-1、α-酮戊二酸最高濃度為1.25 mmol·L-1時，可以擬合出S型曲線，信噪比為7.3，說明二者可以結(jié)合，Kd值為(9.75±4.72) μmol·L-1；而GlnK-G89A蛋白與α-酮戊二酸互作，卻無法擬合出S型曲線，不能判定二者發(fā)生了結(jié)合。表明GlnK蛋白在體外可以與α-酮戊二酸結(jié)合，G89位點(diǎn)可能與二者互作有關(guān)，這也進(jìn)一步的說明了在A1501菌中GlnK可能通過與α-酮戊二酸互作，從而參與固氮調(diào)控過程。

A：glnk-G89A-1基因片段擴(kuò)增；B：glnk-G89A-2基因片段擴(kuò)增；C：glnk-G89A-1與glnk-G89A-2片段的融合；D：重組載體pET28a-glnk-G89A PCR驗(yàn)證；M—Trans2K Plus II DNA Marker；圖中數(shù)字均代表相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。圖5 pET28a-glnk-G89A重組載體的PCR驗(yàn)證Fig.5 Verification of recombinant pET28a-glnk-G89A prokaryotic expression vector

注：M—標(biāo)椎蛋白分子量Marker(kD)；1—未誘導(dǎo)細(xì)胞；2—破碎后上清；3—破碎后沉淀；4—破碎后上清第一次過分離柱濾液；5～6—洗脫液中的GlnK蛋白。圖6 SDS-PAGE分析GlnK蛋白純化Fig.6 SDS/PAGE analysis of the purification of GlnK

3 討論

PⅡ蛋白在大多數(shù)生物中結(jié)構(gòu)較為保守，在GlnB/K亞家族中，一級氨基酸序列通常含有112個氨基酸，高級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)較為統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)構(gòu)像。大腸桿菌PⅡ蛋白三聚體通常形成約30 A°的緊湊桶，每個單體包含2個α螺旋和6個β折疊，對于T環(huán)、B環(huán)與C環(huán)的穩(wěn)定具有十分重要的作用[10-11]。T環(huán)是含有氨基酸最多的環(huán)，在大多數(shù)情況下，該環(huán)為PⅡ蛋白與其他靶蛋白相互作用的表面，該蛋白與小分子物質(zhì)α-酮戊二酸、ATP等配體結(jié)合后會影響T環(huán)的構(gòu)像，進(jìn)而影響該蛋白與其他靶標(biāo)蛋白的結(jié)合。B環(huán)與C環(huán)較小，B環(huán)位于中央核心位置，含有十分保守的Walker A基序，而C環(huán)的Arg101和Arg103也是PⅡ蛋白中較為保守的集團(tuán)[12]。PⅡ與α-酮戊二酸的結(jié)合是該蛋白的一般特性，不同的生物體中也存在差異，研究表明枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中GlnK只能較弱的結(jié)合α-酮戊二酸，而古生菌(Archaeoglobusfulgidus)中未發(fā)現(xiàn)GlnK2與α-酮戊二酸的結(jié)合，但該菌的GlnK3卻可以與α-酮戊二酸結(jié)合[13-14]。

注：M—標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量Marker(kD)；1—未誘導(dǎo)細(xì)胞破碎后沉淀；2—未誘導(dǎo)細(xì)胞破碎后上清；3—誘導(dǎo)細(xì)胞破碎后沉淀；4—誘導(dǎo)細(xì)胞破碎后上清；5～7：洗脫液中的GlnK-G89A蛋白。圖7 SDS-PAGE分析GlnK-G89A蛋白純化Fig.7 SDS/PAGE analysis of the purification of GlnK-G89A

圖8 α-酮戊二酸分別與GlnK蛋白、GlnK-G89A蛋白結(jié)合能力鑒定Fig.8 Determination of the binding affinity of α-ketoglutarate to GlnK and GlnK-G89A respectively by microscale thermophoresis

聯(lián)合固氮菌施氏假單胞菌A1501，唯一的PⅡ蛋白GlnK在固氮調(diào)控中具有十分重要的作用，通過與其他菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)該菌與棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)的親源關(guān)系最近，其次為大腸桿菌(Escherichiacoli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)，而與巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)進(jìn)化關(guān)系相對較遠(yuǎn)，可能A1501中GlnK與α-酮戊二酸結(jié)合位點(diǎn)與大腸桿菌的較為相似。在巴西固氮螺菌的PⅡ蛋白中，Lys58可以與α-酮戊二酸的羧基端形成鹽橋，Gln39為Mg2+提供第六配體，α-酮戊二酸、ATP與Mg2+三者共同結(jié)合于PⅡ蛋白相鄰亞基的裂縫及側(cè)向裂縫中[15]。在古生菌與細(xì)長聚球藻中α-酮戊二酸與PⅡ的結(jié)合位點(diǎn)與之相似，在PⅡ蛋白中Gln39與Lys58都較為保守，可能與α-酮戊二酸結(jié)合有關(guān)[16-17]。大腸桿菌PⅡ蛋白突變研究表明Gln39位點(diǎn)突變后，雖嚴(yán)重的影響了該蛋白的尿苷?；揎棧辉谝欢ǔ潭壬嫌绊懥伺cα-酮戊二酸的相互作用，而Gly89位點(diǎn)突變后，PⅡ蛋白在任何條件下都不能與α-酮戊二酸和ATP結(jié)合[18]。Gly89位點(diǎn)十分保守，處于PⅡ蛋白最保守的區(qū)域之一的Walker A基序TGxxGDGKI之中，可能與α-酮戊二酸和ATP結(jié)合有關(guān)[19]。將A1501的GlnK蛋白與其他菌的蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，GlnK也含有Walker A基序TGxxGDGKI，G89位點(diǎn)位于第7位。對GlnK蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明該蛋白為同源三聚體，該建模結(jié)果與模板相似度可達(dá)78.8%，表明該蛋白與已報道的PⅡ蛋白結(jié)構(gòu)較為一致。

為了解析碳信號分子α-酮戊二酸在A1501中的信號傳導(dǎo)機(jī)制，本研究采用微量熱泳動技術(shù)對GlnK蛋白與碳信號分子α-酮戊二酸的體外互作進(jìn)行研究，該技術(shù)與經(jīng)典的研究分子互作的等溫量熱滴定儀(isothermal titration calorimetry，ITC)相似，靈敏度高且操作簡便，并且本方法較接近天然的測定環(huán)境，可以快速的檢測離子、片段、大分子等各種生物分子之間的相互作用，是一種新的檢測生物分子互作技術(shù)[20-21]。微量熱泳動結(jié)果表明A1501的GlnK可以與α-酮戊二酸體外結(jié)合，并且與大腸桿菌相似，G89位點(diǎn)在結(jié)合的過程中起關(guān)鍵作用。本研究將G89位點(diǎn)突變?yōu)榱薃，根據(jù)K-D法所定義的20種氨基酸疏水特性的參數(shù)表[22]發(fā)現(xiàn)G疏水性參數(shù)為0.4，而G89突變后的A為1.8，疏水性增加，更加容易暴露于蛋白質(zhì)表面，可能對結(jié)合于環(huán)與環(huán)裂縫的α-酮戊二酸產(chǎn)生了空間位阻，影響了二者的結(jié)合。然而該位點(diǎn)突變是否影響GlnK蛋白在固氮調(diào)控中的作用，還需進(jìn)一步研究證實(shí)。但該結(jié)果為進(jìn)一步的解析碳信號分子α-酮戊二酸在A1501中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)奠定了基礎(chǔ)，也為深入解析不同固氮菌的碳氮代謝偶聯(lián)機(jī)制提供了理論支持。