黃 侃 史慧穎 王淑男 霍艷萍 劉燦君 那靜濤

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院心血管二科,齊齊哈爾 161000)

擴(kuò)張型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)屬于原發(fā)性心肌病，其主要特征為心臟收縮功能障礙及左心室擴(kuò)張，其具有較高的發(fā)病率并可導(dǎo)致患者心力衰竭[1]。目前DCM發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，既往研究認(rèn)為免疫紊亂、自身免疫心肌炎及炎癥損傷等均可導(dǎo)致DCM發(fā)生[2]。故而深入探究DCM患者免疫紊亂機(jī)制對(duì)尋找DCM治療靶點(diǎn)具有重要意義。CD4+T細(xì)胞屬于免疫系統(tǒng)重要細(xì)胞亞群，研究發(fā)現(xiàn)DCM患者心臟組織均發(fā)生CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)，CD4+T細(xì)胞可促使炎癥介質(zhì)釋放并引起心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致心功能惡化[3]。同時(shí)相關(guān)報(bào)道指出DCM患者外周血中表面活化標(biāo)記物CD25和CD69表達(dá)增加并可促進(jìn)心衰發(fā)生[4]。以上研究表明DCM患者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫紊亂并可能促進(jìn)心功能惡化。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性單鏈小RNA并可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)，研究顯示miRNA可調(diào)控T淋巴細(xì)胞發(fā)育及分化等過(guò)程[5]。研究表明 T細(xì)胞活化后微小RNA-33b(miR-33b)表達(dá)水平明顯降低并可調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)[6]。CD4+T細(xì)胞異?；罨梢l(fā)DCM患者炎癥損傷，miR-33b又可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，但miR-33b與CD4+T細(xì)胞在DCM發(fā)病機(jī)制中的作用關(guān)系尚未研究。通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)Myc是miR-33b的靶基因，Myc作為多效能轉(zhuǎn)錄因子又可被T細(xì)胞中細(xì)胞因子激活進(jìn)而參與細(xì)胞增殖及分化過(guò)程[7]。因此，本研究通過(guò)分析miR-33b對(duì)T細(xì)胞活化的調(diào)控作用及其在DCM發(fā)生過(guò)程中的作用，初步探討其是否通過(guò)靶向調(diào)控Myc表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，為進(jìn)一步揭示DCM患者免疫活化機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1DCM患者一般資料 收集2015年3月至2016年4月本院收治的45例DCM患者為研究對(duì)象，作為DCM組，所有患者均符合WHO原發(fā)性擴(kuò)張性心肌病診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。DCM組患者中男25例，女20例，年齡45～67歲，平均年齡為(52.31±5.52)歲。同時(shí)選取同期本院體檢中心健康志愿者30例為正常組，其中男18例，女12例，年齡42～70歲，平均年齡為(53.62±6.17)歲。兩組受試者年齡、性別等比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：DCM患者左心室舒張期末直徑高于5.5 cm且右心室射血分?jǐn)?shù)低于45%；未接受類固醇激素等治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：血性心肌病患者；合并高血壓性心臟病及心臟瓣膜病患者；自身免疫性疾病或嚴(yán)重感染者；合并嚴(yán)重內(nèi)分泌疾病患者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者知情且簽署同意書。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料 人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat T購(gòu)自武漢華連科生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胰酶購(gòu)自杭州仟諾生科技有限公司；雙熒光報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；雙熒光報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京白奧萊博科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；anti-CD3、anti-CD28、anti-CD4-FITC抗體、anti-CD25-PE抗體、anti-CD69-PE-Cy7抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；白細(xì)胞介素-2(IL-2)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Bio-sciences公司；MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-33b mimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)及其陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪基因制藥技術(shù)有限公司；Myc siRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Trizol試劑與SYBR Green qPCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；M-MLV Reverse Transcription Kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；兔抗人Myc多克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自中山金橋生物技術(shù)有限公司；Western blot所需試劑購(gòu)自上海西寶生物科技股份有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自美國(guó)MP Biomedicals公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs) 采用肝素鈉抗凝試管收集兩者受試者外周靜脈血5 ml，2 500 r/min離心8 min，收集上層血漿，加入等體積無(wú)菌PBS緩沖液，另取10 ml無(wú)菌離心管，加入等體積淋巴細(xì)胞分離液，緩慢加入外周血，離心機(jī)中2 500 r/min離心20 min，取出中間PBMCs層，加入4 ml PBS緩沖液，混勻，1 600 r/min離心6 min，棄上清并收集細(xì)胞，加入紅細(xì)胞裂解液(2 ml)，混勻，室溫靜置2 min，加入PBS緩沖液至8 ml，混勻后離心并收集細(xì)胞，采用RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度2×106ml-1，采用免疫磁珠分選法(MACS)分離CD4+T細(xì)胞，具體方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[9]，收集CD4+T細(xì)胞置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清、青霉素及鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Jurkat T細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合至60%～70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前一天將Jurkat T細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔分別接種2×105個(gè)細(xì)胞，同時(shí)分別將miRNA陰性對(duì)照、miR-33b mimic、anti-miRNA及miR-33b抑制劑溶解于OPYI-MEM培養(yǎng)基(50 μl)，混勻后加入2 μl Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫孵育20 min，向96孔板中每孔加入100 μl上述miRNA配置混合液，分別為miR-con組、miR-33b組、anti-miR-con組 及anti-miR-33b組。采用小RNA干擾技術(shù)沉默Myc表達(dá)，分別將Myc siRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法與miR-33b轉(zhuǎn)染方法相同，分別為si-con組、si-Myc組。轉(zhuǎn)染后置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，6 h后更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)miR-33b 、Myc mRNA表達(dá) CD4+細(xì)胞與Jurkat T細(xì)胞均按照Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，利用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA濃度及純度，以A260與A280比值在1.8～2.0之間為RNA濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。引物序列：miR-33b正向引物為：5′-ATTCTTTCGAACTGTCTTGG-3′，反向引物為：5′-TTCACCCTCGGCTGTCCTTGACA-3′；Myc正向引物為：5′-AATGAAAAGGCCCCCAAGGTAGTTATCC-3′，反向引物為：5′-GTCGTTTCCGCAACAAGTCCTCTTC-3′。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件為95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共30次循環(huán)，72℃終延伸10 min。qRT-PCR反應(yīng)均嚴(yán)格按照SYBR Green qPCR試劑盒說(shuō)明書操作。miR-33b 、Myc 的溶解曲線見(jiàn)圖1。

圖1 miR-33b與Myc的溶解曲線Fig.1 Dissolution curve of miR-33b and Myc

1.2.4Western blot檢測(cè)Myc蛋白表達(dá) 取各組Jurkat T細(xì)胞及CD4+細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉60 min，分別加入Myc(1∶200)、GAPDH(1∶1 000)一抗，4℃冰箱內(nèi)保存過(guò)夜，次日加入IgG(1∶5 000)，室溫孵育1 h，經(jīng)化學(xué)發(fā)光試劑顯影，Myc以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表面活化標(biāo)記物CD25和CD69的表達(dá) 收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Jurkat T細(xì)胞，用anti-CD3/28刺激Jurkat T細(xì)胞24 h，用anti-CD4-FITC、anti-CD25-PE、anti-CD69-PE-Cy7抗體標(biāo)記后，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，采用FlowJo7.6軟件分析CD25和CD69平均熒光強(qiáng)度(MFI)。

1.2.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Jurkat T細(xì)胞，0.25%胰酶消化，接種至96孔板，每孔細(xì)胞密度為5×103個(gè)，每孔體積為100 μl，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h、48 h、72 h后分別在每孔加入50 μl MTT試劑，然后加入150 μl DMSO，避光室溫下孵育10 min，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。

1.2.7檢測(cè)T細(xì)胞活化功能 分別將Jurkat T細(xì)胞鋪于96孔U底板(2×105個(gè)/孔)，用anti-CD3/28抗體刺激，24 h后收集細(xì)胞上清液，采用ELISA法檢測(cè)IL-2水平，嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作。

1.2.8雙熒光素酶活性檢測(cè) 收集呈指數(shù)式生長(zhǎng)的Jurkat T細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后棄培養(yǎng)基，然后在每孔加入300 μl 1×Passive Lysis Buffer，放入4℃冰箱內(nèi)，20 min后取出并混勻，吸取40 μl細(xì)胞裂解液置于Lockwell maxisorp檢測(cè)板，再加入Luciferase Assay Reagent(20 μl)，混勻后檢測(cè)螢火蟲熒光素酶熒光值，之后加入Stop & Glo Reagent(20 μl/孔)，混勻后室溫放置3 min，檢測(cè)海腎熒光酶熒光值。

2 結(jié)果

2.1擴(kuò)張型心肌病患者CD4+細(xì)胞中miR-33b和Myc的表達(dá) 通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)DCM患者CD4+細(xì)胞中miR-33b及Myc mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示DCM組患者CD4+細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平相較于正常組顯著降低(t=10.528，P<0.000 1)，Myc mRNA表達(dá)水平顯著升高(t=11.238，P<0.000 1)，見(jiàn)圖2A、B。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示DCM組患者CD4+細(xì)胞中Myc蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組(t=8.718，P<0.000 1)，見(jiàn)圖2C。采用Pearson法分析DCM患者CD4+細(xì)胞中miR-33b與Myc蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-33b與Myc呈負(fù)相關(guān)(F=14.091，P<0.05)，見(jiàn)圖2D。

圖2 DCM患者CD4+細(xì)胞中miR-33b和Myc的表達(dá)Fig.2 Expression of miR-33b and Myc in CD4+ cells from DCM patientsNote:A.Down-regulation of miR-33b expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group；B.Upregulation of Myc mRNA expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group；C.Upregulation of Myc protein expression in circulating CD4+ cells in DCM patients compared with normal group；D.Negative correlation between Myc protein expression in circulating CD4+ cells in DCM patients.Compared with Normal group,*.P<0.05.

2.2miR-33b對(duì)Jurkat T細(xì)胞活化的影響 分別將miR-33b mimic、miR-33b抑制劑(anti-miRNA)轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后采用qRT-PCR法檢測(cè)Jurkat T細(xì)胞中miR-33b表達(dá)，結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平顯著高于miR-con組，anti-miR-33b組Jurkat T細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平顯著低于anti-miR-con組(F=219.514，P<0.000 1)，見(jiàn)圖3A。提示轉(zhuǎn)染效果良好可用于后續(xù)研究。用anti-CD3/28刺激Jurkat T細(xì)胞24 h，流式檢測(cè)表面活化標(biāo)記物CD25和CD69的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細(xì)胞中CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于miR-con組，anti-miR-33b組Jurkat T細(xì)胞中CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著高于anti-miR-con組(FCD25=32.532，F(xiàn)CD69=75.971，F(xiàn)IL-2=38.084，P<0.000 1)，見(jiàn)圖3B～D。結(jié)果表明miR-33b過(guò)表達(dá)可抑制Jurkat T細(xì)胞活化，抑制miR-33b表達(dá)可促進(jìn)Jurkat T細(xì)胞活化。

圖3 miR-33b調(diào)控Jurkat T細(xì)胞活化Fig.3 miR-33b regulates Jurkat T cell activationNote:A.Detection of miR-33b expression in Jurkat T cells 48 h after transfection；B，C.After 48 h transfection,Jurkat T cells were stimulated with anti-CD3/28 for 24 h,and the expression of surface activation markers CD25 and CD69 were detected by flow cytometry；D.ELISA for detection of IL-2 concentration in cell supernatant.Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

2.3miR-33b對(duì)Jurkat T細(xì)胞增殖的影響 MTT檢測(cè)Jurkat T細(xì)胞增殖能力，結(jié)果顯示miR-33b 組Jurkat T細(xì)胞增殖活性顯著低于miR-con組，anti-miR-33b組Jurkat T細(xì)胞增殖活性顯著高于anti-miR-con組(F=23.044，P<0.000 1)，見(jiàn)圖4。結(jié)果表明miR-33b過(guò)表達(dá)可抑制Jurkat T細(xì)胞增殖，抑制miR-33b表達(dá)可促進(jìn)Jurkat T細(xì)胞增殖。

圖4 miR-33b調(diào)控Jurkat T細(xì)胞增殖Fig.4 miR-33b regulates Jurkat T cell proliferationNote:Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

2.4miR-33b靶向Myc調(diào)控其表達(dá) 靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)出miR-33b與Myc 3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖5A。分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，分別將WT-Myc、MUT-Myc與miR-con組共轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，檢測(cè)Jurkat T細(xì)胞熒光活性，結(jié)果顯示野生型WT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞熒光活性比WT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞熒光活性顯著降低(t=6.507，P=0.03)，突變型MUT-Myc與miR-con共轉(zhuǎn)染相較于MUT-Myc與miR-33b mimic共轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞熒光活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.905，P=0.130)，見(jiàn)圖5B。Western blot法驗(yàn)證miR-33b對(duì)Myc蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，結(jié)果顯示miR-33b組Jurkat T細(xì)胞中Myc蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，anti-miR-33b組Jurkat T細(xì)胞中Myc蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5C。結(jié)果表明miR-33b可負(fù)向調(diào)控靶基因Myc表達(dá)。

圖5 miR-33b靶向Myc mRNA調(diào)控其蛋白表達(dá)Fig.5 miR-33b targets Myc mRNA to regulate its protein expressionNote:Compared with miR-con group,*.P<0.05;compared with anti-miR-con group,#.P<0.05.

2.5沉默Myc抑制Jurkat T細(xì)胞活化和增殖 將Myc siRNA及其陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Jurkat T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細(xì)胞中Myc蛋白表達(dá)水平顯著低于si-con組(F=43.279，P<0.000 1)，見(jiàn)圖6A，提示轉(zhuǎn)染成功。進(jìn)一步分析沉默Myc表達(dá)對(duì)Jurkat T細(xì)胞活化和增殖的影響，結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細(xì)胞CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于si-con組(FCD25=67.278，F(xiàn)CD69=30.855，F(xiàn)IL-2=208.496，P<0.05)，Jurkat T細(xì)胞活性明顯降低(F=13.838，P=0.006)，見(jiàn)圖6B～E。結(jié)果表明沉默Myc 表達(dá)可抑制Jurkat T細(xì)胞活化并降低細(xì)胞增殖能力。

圖6 Myc表達(dá)對(duì)Jurkat T細(xì)胞活化和增殖的影響Fig.6 Effect of Myc expression on activation and proliferation of Jurkat T cellsNote:A.Detection of Myc expression in Jurkat T cells after 48 hours of transfection；B，C.Expression of surface activation markers CD25 and CD69；D.ELISA for detection of IL-2 concentration in cell supernatant；E.Detection of Jurkat T cell proliferation.Compared with si-con group,*.P<0.05.

3 討論

CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)可促進(jìn)DCM發(fā)生及發(fā)展，DCM患者外周血CD4+T細(xì)胞異?；罨蓳p傷機(jī)體免疫功能[10]。miRNA與T細(xì)胞激活及分化密切相關(guān)，T細(xì)胞激活可通過(guò)增加細(xì)胞代謝進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫功能，同時(shí)還可調(diào)控miRNA表達(dá)并間接調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞增殖，miRNA異常表達(dá)還可通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞增殖[11-13]。miR-33b在食管鱗狀細(xì)胞癌中呈低表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程，研究表明miR-33可通過(guò)調(diào)控ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[14，15]。關(guān)于miR-33b在DCM發(fā)生過(guò)程中的作用尚未有相關(guān)研究報(bào)道，本研究結(jié)果顯示DCM患者CD4+T細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平低于正常組，說(shuō)明miR-33b可能參與DCM發(fā)生過(guò)程。提示miR-33b表達(dá)水平異?？赡芡ㄟ^(guò)引起機(jī)體免疫系統(tǒng)紊亂進(jìn)而導(dǎo)致DCM發(fā)生。通過(guò)靶向預(yù)測(cè)軟件得出Myc與miR-33b基因序列存在結(jié)合位點(diǎn)，研究顯示抑制Myc表達(dá)可抑制T細(xì)胞活化及增殖，同時(shí)Myc表達(dá)水平升高還與白血病病毒感染有關(guān)[16，17]。本研究結(jié)果顯示DCM患者CD4+T細(xì)胞中Myc mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于正常組，miR-33b與Myc呈負(fù)相關(guān)，提示miR-33b與Myc異常表達(dá)可促進(jìn)DCM發(fā)生及發(fā)展。但Myc與miR-33b是否存在直接靶向關(guān)系及其對(duì)DCM患者T細(xì)胞活化及增殖的調(diào)控作用如何均需進(jìn)行深入研究。

CD69可作為T淋巴細(xì)胞表面活化的早期標(biāo)志，抗原刺激T淋巴細(xì)胞時(shí)CD69表達(dá)上調(diào)[18]。CD4+T細(xì)胞早期免疫活化標(biāo)志物CD25、CD69表達(dá)增加可能是DCM患者免疫激活的重要因素[19]。研究發(fā)現(xiàn)IL-2是Myc轉(zhuǎn)錄后發(fā)揮調(diào)控作用中的重要因子，IL-2可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞合成相關(guān)miRNA，miRNA又可通過(guò)靶向抑制Foxol因子表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖[20，21]。提示IL-2在CD4+T細(xì)胞活化及增殖過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究選用T淋巴細(xì)胞系Jurkat T細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討miR-33b、Myc與T淋巴細(xì)胞活化及增殖的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)將miR-33b過(guò)表達(dá)及抑制表達(dá)后，結(jié)果顯示miR-33b過(guò)表達(dá)后Jurkat T細(xì)胞中CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及細(xì)胞增殖能力均顯著降低，抑制miR-33b表達(dá)后Jurkat T細(xì)胞中CD25、CD69 MFI值、IL-2水平及細(xì)胞增殖能力均顯著升高，說(shuō)明miR-33b表達(dá)水平升高可有效抑制Jurkat T細(xì)胞活化及增殖。提示Jurkat T細(xì)胞中miR-33b表達(dá)水平降低可促進(jìn)免疫活化及增殖。同時(shí)本研究熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示Myc是miR-33b的靶基因，miR-33b可負(fù)向調(diào)控靶基因Myc表達(dá)。提示miR-33b、Myc表達(dá)異?？赡芘cDCM過(guò)度免疫激活有關(guān)。通過(guò)沉默Myc表達(dá)進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)T細(xì)胞活化的調(diào)控作用，結(jié)果顯示si-Myc組Jurkat T細(xì)胞CD25、CD69 MFI值及IL-2水平均顯著低于si-con組，Jurkat T細(xì)胞活性明顯降低，說(shuō)明降低Myc表達(dá)可有效抑制T細(xì)胞活化。提示miR-33b可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控Myc表達(dá)并減少IL-2分泌量進(jìn)而抑制T細(xì)胞增殖及活化。

綜上所述，DCM患者CD4+T細(xì)胞中miR-33b表達(dá)下調(diào)并可促進(jìn)Myc表達(dá)進(jìn)而促使T細(xì)胞異?；罨@可能是DCM發(fā)病機(jī)制之一，為提高DCM治療效果提供潛在靶標(biāo)基因。但CD4+T細(xì)胞活化及增殖過(guò)程較為復(fù)雜，涉及轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、多種miRNA等調(diào)控過(guò)程，因而需進(jìn)一步探究miR-33b與Myc對(duì)T細(xì)胞活化及增殖的調(diào)控機(jī)制。