李夢(mèng)夏 徐宏炎 韋敏光 包卓華 徐 肖 劉競(jìng)麗 李勁頻

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530021)

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG )是一種由乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)介導(dǎo)、細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與的累及神經(jīng)肌肉接頭處傳遞功能障礙的獲得性自身免疫性疾病[1,2]，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。微小核糖核酸(miRNA)是一類平均長(zhǎng)度為22個(gè)核苷酸(nt)的小分子非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用，涉及細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡等主要的生物過程[3，4]。研究表明,miRNA可作為多種自身免疫疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物[5]。外泌體是直徑范圍30～100 nm、密度范圍1.13～1.19 g/ml，由細(xì)胞釋放到細(xì)胞外空間或生物液體中的小膜包裹的微小囊泡，存在于許多生物液體中，包括血液(血清、血漿)、尿液、唾液、母乳、羊水、腹水、腦脊液、膽汁和細(xì)胞上清液等，富含核酸和蛋白質(zhì)，通過向遠(yuǎn)處的組織傳遞信息，介導(dǎo)細(xì)胞間的通訊，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、死亡和免疫反應(yīng)等[6-9]。外泌體保護(hù)miRNA免受血漿RNA酶的侵襲，在不同的儲(chǔ)存條件下，均能保持較好的穩(wěn)定性，因此，外泌體miRNA可作為疾病潛在的生物標(biāo)志物[10-12]。目前尚未見MG血漿外泌體miRNA的相關(guān)報(bào)道，因此我們研究了MG患者血漿外泌體miRNA的差異表達(dá)譜，以尋找診斷MG的潛在生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 收集2017年3月～2017年8月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院確診的MG患者8例，MG組納入標(biāo)準(zhǔn)：①隨意肌無(wú)力，伴有典型的活動(dòng)后癥狀加重、休息后減輕或晨輕暮重現(xiàn)象，并且肌疲勞試驗(yàn)陽(yáng)性。②新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性。③肌電圖呈現(xiàn)低頻重復(fù)神經(jīng)電刺激波幅遞減和(或)單纖維肌電圖顫抖(Jitter)增寬。④血清抗AchR抗體滴度升高。具備上述診斷標(biāo)準(zhǔn)中的①，同時(shí)至少具備②～④中的一項(xiàng)，即明確診斷為重癥肌無(wú)力。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除妊娠期女性以及合并心、肺、肝、腎功能衰竭患者。設(shè)立年齡及性別匹配的健康體檢者為對(duì)照組。重癥肌無(wú)力組中OMG 4例[女∶男=4∶0，年齡(23.0±12.2)歲]，GMG 4例[女∶男=3∶1，年齡(38.5±13.5)歲]；對(duì)照組2例[女∶男=1∶1，年齡(30.0±7.1)歲]。用含EDTA的抗凝管收集患者及健康對(duì)照者全血5 ml，備用。各組間患者年齡、性別構(gòu)成比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性。本研究通過廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有患者及對(duì)照者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器 外泌體試劑盒exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit(德國(guó) QIAGEN公司)，透射電子顯微鏡(日本日立集團(tuán)H7650)，miRNA(v.18.0)基因芯片(廣州市銳博生物科技有限公司)，Genesis軟件。

1.2方法

1.2.1血漿外泌體的分離與鑒定 ①外泌體的提?。喝』颊呋蚪】祵?duì)照者全血5 ml，4℃條件下，3 000 r/min離心15 min取上清液，按照說明書利用外泌體試劑盒exoRNeasySerum/PlasmaMidiKit進(jìn)行提?。虎谕饷隗w的鑒定：透射電鏡法鑒定exosomes：將提取的exosomes做BCA 蛋白定量,用PBS( pH = 7.4 ) 將濃度稀釋為0.5 mg/ml，吸取20 μl 滴到碳膜銅網(wǎng)上，置于紅外燈下5 min至烘干，在碳膜銅網(wǎng)上滴1滴1%磷鎢酸，置于紅外燈下5 min 至烘干，H7650透射電鏡下觀察。

1.2.2不同類型MG患者血漿外泌體源性miRNA表達(dá)譜差異的比較分析 采用深度測(cè)序聯(lián)合芯片技術(shù)(由廣州銳博生物科技有限公司完成)，對(duì)不同類型(眼肌型、全身型)MG患者血漿外泌體源性miRNA的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并與健康對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)外泌體源性miRNA在各組之間的相對(duì)表達(dá)量，篩選出在血漿中表達(dá)差異的外泌體源性miRNA，從而獲得不同MG類型相關(guān)的血漿候選外泌體源性miRNA。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 芯片數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用Edge R軟件，由廣州銳博生物科技有限公司完成；芯片聚類分析應(yīng)用Genesis軟件。差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為：上調(diào)者其log2(Fold change)值>2，下調(diào)者其log2(Fold change)值<-2，以P<0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1血漿外泌體分離和鑒定 利用透射電鏡觀察所提血漿外泌體形態(tài)，可以看出外泌體呈圓形或類圓形，雙層脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，大小分布不均勻，直徑范圍在 30～100 nm(圖1)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：CD63陽(yáng)性率66.9%，CD81陽(yáng)性率89.1%(圖2)。上述結(jié)果與正常外泌體特點(diǎn)相符。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)外泌體表面特異性標(biāo)志CD63和CD81表達(dá)水平Fig.2 Exosome surface specific markers CD63 and CD81 expression levels detected by flow cytometryNote:A.Scatter plot；B，C.Unstained negative control；D.CD63 staining；E.CD81 staining.

2.2分析血漿外泌體源性miRNA的表達(dá) 采用Genesis分析軟件對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析， 結(jié)果見圖3A、B。OMG 組與正常對(duì)照組比較有顯著差異表達(dá)的 miRNA 共4個(gè) (表1) ， 其中1個(gè)下調(diào)，為hsa-miR-3667-5p，3個(gè)上調(diào)，上調(diào)最顯著的為hsa-miR-3182；GMG組與正常對(duì)照組比較有顯著差異表達(dá)的miRNA共48個(gè)(表2)，其中下調(diào)16個(gè)，下調(diào)最顯著的為hsa-miR-516a-5p，32個(gè)上調(diào)，上調(diào)最顯著的為hsa-miR-1273f。 將OMG、GMG組中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)OMG組中差異表達(dá)的4個(gè)miRNA，在GMG組中均有一致的差異表達(dá)。見表1、表2。

表1 OMG組與正常對(duì)照組顯著差異表達(dá)的血漿外泌體miRNATab.1 Plasma exosomes miRNAs significantly different in OMG group and normal control group

表2 GMG組與正常對(duì)照組顯著差異表達(dá)的血漿外泌體miRNATab.2 Plasma exosomes miRNAs significantly different in GMG group and normal control group

圖3 聚類分析熱圖Fig.3 Cluster analysis heat mapNote:A.Cluster analysis heat map of OMG group and normal control group；B.Cluster analysis heat map of GMG group and normal control group.In the figure,red indicates that miRNA is up-regulated,and green indicates that miRNA is down-regulated;the small picture above is a chroma key diagram,and different color gradients represent different expression levels.

3 討論

2012年Lin等[13]首次報(bào)道了重癥肌無(wú)力與miRNA的相關(guān)研究，他們分析了MG患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)21個(gè)過表達(dá)的miRNA，其中l(wèi)et-7家族水平顯著降低，并發(fā)現(xiàn)其抑制了Jurkat細(xì)胞中白介素- 10的表達(dá)，從而影響MG發(fā)病和進(jìn)展。重癥肌無(wú)力與胸腺異常關(guān)系密切，本課題組前期研究了MG患者異常胸腺(胸腺瘤、胸腺增生)與正常胸腺miRNA表達(dá)譜的差異，也發(fā)現(xiàn)了MG患者胸腺組織中有多個(gè)異常表達(dá)的miRNA[14]，我們還通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)到其中miR-125a-5p的靶基因?yàn)镕oxp3，并證明了Foxp3基因在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)受miR-125a-5p調(diào)控[15]。此外，我們?cè)诎樾叵僭錾腗G患者miRNA的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-548k負(fù)調(diào)控Jurkat細(xì)胞中CXCL13 mRNA的表達(dá)[16]。這些研究發(fā)現(xiàn)不同的miRNA可能通過調(diào)控不同的與免疫相關(guān)的靶基因影響MG的發(fā)病和進(jìn)展。

而在一項(xiàng)AchR-Ab陽(yáng)性MG的研究中，miR-150-5p和miR-21-5p在血清中表達(dá)增高，但在使用免疫抑制劑后表達(dá)降低[17]。 Zhang等[18]發(fā)現(xiàn)使用miR-146a抑制劑沉默miR-146a可有效改善實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力小鼠的臨床肌無(wú)力癥狀，并且在B細(xì)胞中敲除miR-146a后觀察到多種缺陷，包括抗R97-116抗體產(chǎn)生減少，漿細(xì)胞、記憶B細(xì)胞和B-1細(xì)胞數(shù)量減少，B細(xì)胞活化減弱；因此認(rèn)為沉默miR-146a可影響B(tài)細(xì)胞的功能，從而在重癥肌無(wú)力的治療中發(fā)揮作用。在最新的一項(xiàng)前瞻性研究中，發(fā)現(xiàn)miR-30e-5p是從OMG轉(zhuǎn)化為GMG的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)因子之一[19]。這些研究表明，重癥肌無(wú)力患者中存在異常表達(dá)的miRNA，可能通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

外泌體是miRNA的富集體，有報(bào)道稱外泌體攜帶功能性mRNA和能夠在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移的miRNA，外周血中的外泌體可能反映了外泌體起源器官的狀態(tài)，因此是疾病潛在的生物標(biāo)志物以及對(duì)疾病的治療或進(jìn)展的預(yù)后指標(biāo)[12，20]。Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)下丘腦神經(jīng)干/祖細(xì)胞分泌的外泌體miRNA介導(dǎo)了部分抗衰老作用。在不同疾病的研究中，都發(fā)現(xiàn)了異常表達(dá)的外泌體miRNA，如急性髓性白血病、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、子癇前期等，這些異常表達(dá)的miRNA有望成為輔助疾病診斷和治療的工具[22-26]。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在OMG組中顯著差異表達(dá)的miRNA有4個(gè)，分別為hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3182、hsa-miR-6843-3p、hsa-miR-1273f；在GMG組中顯著差異表達(dá)的miRNA有48個(gè)；并且OMG組中顯著差異表達(dá)的4個(gè)miRNA，在GMG組中均發(fā)現(xiàn)了一致的差異表達(dá)，說明OMG與GMG可能存在共同的發(fā)病機(jī)制，也說明這4個(gè)差異表達(dá)的miRNA與MG的發(fā)生有關(guān)。其中hsa-miR-3667-5p、hsa-miR-3182在其他疾病的研究中也有相關(guān)的報(bào)道，例如，Kaur等[27]研究發(fā)現(xiàn)了hsa-miR-3667-5p在復(fù)雜間日瘧原蟲病中具有顯著的差異表達(dá)；在一項(xiàng)研究腎臟疾病miRNA的研究中，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-3182在IgA腎病患者中顯著下調(diào)，此外，hsa-miR-3182在肺腺癌、結(jié)直腸癌、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中均發(fā)現(xiàn)有差異表達(dá)[28-30]；提示當(dāng)miRNA異常表達(dá)時(shí)，它們可能導(dǎo)致涉及免疫系統(tǒng)的病理狀態(tài)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，如癌癥和自身免疫性疾病等。而顯著差異表達(dá)的hsa-miR-6843-3p、hsa-miR-1273f未見相關(guān)報(bào)道，我們推測(cè)其可能是MG中差異表達(dá)的miRNA，通過特定的機(jī)制參與MG的發(fā)病和進(jìn)展。我們的研究也是首次對(duì)MG患者血漿外泌體miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè)，下一步將通過體內(nèi)外模型對(duì)這些差異表達(dá)的miRNA在MG診斷中的作用進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)了MG患者血漿外泌體中存在多個(gè)差異表達(dá)的miRNA，提示其在MG疾病的發(fā)生發(fā)展中可能存在一定的作用，而顯著差異表達(dá)的miRNA，特別是hsa-miR-6843-3p和hsa-miR-1273f，可進(jìn)一步研究其作為診斷MG的潛在生物標(biāo)志物的可能性。