劉雅輝，孫建平，馬佳，姚玉濤，呂晶晶，張宏偉

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北省鹽地綠化工程技術(shù)研究中心，唐山市耐鹽植物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 曹妃甸 063299；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分[1]，不僅反映了土壤的生物性狀，而且也是土壤有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與循環(huán)的動力[2-3]，在土壤結(jié)構(gòu)形成、土壤肥力和營養(yǎng)元素轉(zhuǎn)化、土壤微生態(tài)平衡保持、土壤環(huán)境凈化及生態(tài)修復(fù)等方面發(fā)揮著重要作用[4]，其群落結(jié)構(gòu)組成是衡量土壤肥力和質(zhì)量的重要指標(biāo)[5-6]。土壤微生物對所處環(huán)境的變化十分敏感[7]，其群落結(jié)構(gòu)和多樣性可以較早地反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化，已被認(rèn)為是重要的生物學(xué)指標(biāo)[8]。磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）是活體微生物細(xì)胞膜的恒定組分[9]，也是表示微生物量的指標(biāo)之一，因此特定菌群PLFA數(shù)量變化可反映原位土壤真菌、細(xì)菌等活體的生物量與菌群結(jié)構(gòu)[10]。PLFA 技術(shù)是一種可定性和定量分析微生物群落多樣性的方法，近年來被廣泛應(yīng)用并取得了大量成果[11-14]。

土壤微生物作為植物與土壤互作的重要紐帶，其群落結(jié)構(gòu)除了受氣候和地理環(huán)境等因素的影響外，植被也是一個(gè)主要影響因素[15]。不同植物種類和種植年限均會對土壤微生物種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，李欣玫等[16]研究表明5 種荒漠植物根際土壤微生物群落組成差異顯著，并可用于檢測不同荒漠植物根際微環(huán)境土壤退化狀況。凃月等[17]研究了廣西會仙濕地不同植物根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，發(fā)現(xiàn)它們之間差異很大。王娟英等[18]對不同連作年限的懷牛膝根際土壤理化性質(zhì)及微生物多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連作使有效磷、堿解氮和速效鉀等含量上升，而且隨著連作年限增加，土壤中總PLFAs、細(xì)菌、革蘭氏陰性菌、真菌含量明顯上升，微生物多樣性增加。劉順等[19]研究表明，不同林齡的紅心杉土壤微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變。另外，土壤的鹽堿度也直接影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成，李新等[20]研究表明內(nèi)蒙古河套灌區(qū)不同鹽堿程度地區(qū)土壤微生物主要以細(xì)菌為主，但隨著鹽堿程度增加，細(xì)菌含量下降。張寧[21]研究了鹽堿地起壟對土壤微生態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)起壟對細(xì)菌、放線菌影響效果顯著。因此研究鹽堿地不同植物種植下土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，對了解鹽堿地土壤環(huán)境狀況和質(zhì)量變化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于河北省唐山市曹妃甸區(qū)天旭生態(tài)園（118°33′40.82″E，39°09′39.35″N），屬于北溫帶大陸性季風(fēng)氣候，四季氣候變化明顯，具有明顯的暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候特征，年平均氣溫11.6 ℃，年平均降水量553.7 mm。土壤類型屬于濱海鹽土，主要鹽分組成以NaCl 為主。試驗(yàn)地土壤容重1.63 g·cm-3，0～20 cm 土壤電導(dǎo)率為1.76 mS·cm-1，pH 為7.58，有機(jī)質(zhì)12.06 g·kg-1，有效氮82 mg·kg-1，有效磷57 mg·kg-1，速效鉀220 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

植物種子或種苗均由河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所提供。為保證種植植物樣地與裸地對照土壤背景一致，在植物生長過程中未施加任何形式的肥料和植物生長調(diào)節(jié)劑，且采用滴灌同時(shí)等量給水。

1.3 樣品采集及主要指標(biāo)測定

1.3.1 樣品采集

于植物生長旺盛期（2018年8月），按“S”形選取5個(gè)點(diǎn)，用土鉆取0～20 cm 土層土壤，去除石子、根系及動物殘?bào)w，過2 mm篩后混合均勻，一份用無菌封口袋密封置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室用于磷脂脂肪酸測定，一份用封口袋密封用于土壤化學(xué)性質(zhì)測定。

1.3.2 土壤微生物PLFAs測定及命名

土壤微生物PLFAs 提取與測定主要參照Bligh等[25]的方法并稍作改進(jìn)，取新鮮土壤8.0 g，用提取液（氯仿∶甲醇∶檸檬酸緩沖液體積比為1∶2∶0.8）提取，再分別用氯仿、丙酮和甲醇洗提，分離和萃取出磷脂，之后與甲醇進(jìn)行酯化反應(yīng)形成脂肪酸甲酯，然后用200 mL正己烷溶解，以C19脂肪酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，利用美國安捷倫科技有限公司的Agilent 7890B 型氣相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱為Agilent 19091B-102 型，檢測器為氫火焰離子（FID），載氣為氫氣，譜儀工作條件為：進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度300 ℃，柱溫箱初始溫度190 ℃,保持0 min,以10 ℃·min-1升溫至285 ℃保持0 min，以60 ℃·min-1升溫至310 ℃保持2 min，進(jìn)樣量為2 μL。然后采用MIDI 公司的Sherlock MIS6.2 系統(tǒng)進(jìn)行脂肪酸的鑒定。脂肪酸的命名參考Frostagard 等[26]的命名方法。根據(jù)前人報(bào)道的磷脂脂肪酸的生物標(biāo)記[19，27]，并結(jié)合MIDI軟件系統(tǒng)自動識別參考劃分微生物類群（表1）。

1.3.3 土壤化學(xué)性質(zhì)的測定

2017年，哈電電機(jī)研制的世界首臺300兆乏全空冷調(diào)相機(jī)投入運(yùn)行，作為電力守護(hù)的“安全衛(wèi)士”，為特高壓電網(wǎng)直流輸電工程提供保障，發(fā)揮了“定海神針”的作用，行業(yè)專家賦予其“技術(shù)水平國際領(lǐng)先”的權(quán)威鑒定。哈電電機(jī)實(shí)現(xiàn)了從單一發(fā)電設(shè)備向發(fā)電設(shè)備、輸電設(shè)備并舉的華麗轉(zhuǎn)身，延伸了產(chǎn)業(yè)鏈條，也使我國遠(yuǎn)距離特高壓直流輸電進(jìn)入嶄新時(shí)代。

參照鮑士旦[28]的方法，土壤電導(dǎo)率測定時(shí)水土比為5∶1，土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀加熱法，土壤有效氮、有效磷和速效鉀分別采用堿解擴(kuò)散法、碳酸氫鈉法和乙酸銨萃取法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

1.4.1 土壤微生物多樣性分析

土壤微生物多樣性采用Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)（H）、Margalef 豐富度指數(shù)（SR）、Pielou 均勻度指數(shù)（J）表示，計(jì)算公式[20,29]如下：

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）：

其中Pi=Ni/N

Margalef豐富度指數(shù)（SR）：

Pielou均勻度指數(shù)（J）：

其中Hmax=lnS

式中：Ni為第i種磷脂脂肪酸含量；N為每個(gè)樣品所有磷脂脂肪酸的含量總和；S為每個(gè)樣品磷脂脂肪酸種類數(shù)。

1.4.2 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），采用Canoco 4.5軟件進(jìn)行主成分分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤化學(xué)性質(zhì)

由表2 可知，與裸地比較，種植植物樣地土壤電導(dǎo)率和速效鉀含量顯著下降，電導(dǎo)率下降了20.26%～57.21%，有效鉀含量下降了23.42%～37.80%；有效磷和有機(jī)質(zhì)含量顯著提高，有效磷提高了106.48%～259.92%，有機(jī)質(zhì)含量提高了39.16%～53.01%；而有效氮含量變化規(guī)律性不明顯。3 種植物樣地中，費(fèi)菜樣地的土壤電導(dǎo)率顯著低于其余2 種植物，有效氮含量顯著高于其余2種植物；蒲公英樣地土壤有效磷含量最高，3種植物樣地的速效鉀和有機(jī)質(zhì)含量差異不顯著。

表1 土壤微生物種類的磷脂脂肪酸生物標(biāo)記Table 1 PLFA biomarker for soil microbes

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性

對種植耐鹽植物及裸地處理下土壤微生物群落PLFAs 含量進(jìn)行分析（表3），結(jié)果表明：與裸地比較，3個(gè)植物樣地土壤中革蘭氏陰性菌、放線菌、AM真菌、真核生物、真菌PFLA含量和總PFLAs含量顯著升高，分別 升 高4.96%～63.37%、82.91%～222.72%、50.00%～160.25%、32.05%～268.59%、19.39%～454.77%、21.53%～103.32%；真菌/細(xì)菌（F/B）PFLA 含量也顯著升高1.00～6.50 倍。其中，革蘭氏陰性菌、真菌和AM 真菌表現(xiàn)為蒲公英＞費(fèi)菜＞田菁＞裸地；放線菌和真核生物表現(xiàn)為費(fèi)菜＞蒲公英＞田菁＞裸地；總PFLAs 大小依次為費(fèi)菜＞田菁＞蒲公英＞裸地；AM真菌、真菌和真菌/細(xì)菌PFLA 含量在蒲公英樣地中顯著高于其余樣地。而植物樣地土壤的革蘭氏陽性菌PFLA 含量卻大幅下降了48.06%～57.78%，大小順序依次為裸地＞費(fèi)菜＞蒲公英＞田菁；革蘭氏陽性菌/革蘭氏陰性菌（G+/G-）PFLA 含量也顯著下降了59.77%～68.68%，但3 個(gè)植物樣地間差異不顯著。

對表征土壤微生物群落多樣性的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H）、豐富度指數(shù)（SR）、均勻度指數(shù)（J）進(jìn)行分析（表4）可以看出，蒲公英樣地多樣性指數(shù)顯著高于裸地（P＜0.05），增幅為22.26%；3個(gè)植物樣地豐富度指數(shù)均顯著高于裸地（P＜0.05），增幅為20.89%～36.31%。多樣性指數(shù)表現(xiàn)為蒲公英＞費(fèi)菜≈田菁＞裸地，豐富度指數(shù)表現(xiàn)為費(fèi)菜＞田菁＞蒲公英＞裸地，4個(gè)樣地均勻度指數(shù)間沒有顯著差異。說明種植耐鹽植物后，土壤微生物種類明顯增加，群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜化。

2.3 土壤微生物PLFA主成分分析

對4個(gè)樣地處理土壤微生物PLFA 進(jìn)行主成分分析（圖1），結(jié)果表明：與土壤微生物PLFA 組成相關(guān)的2 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)96.3%，其中第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別解釋變量方差的82.9%和13.4%，對PC1起主要作用的微生物PLFA 有32 個(gè)，其中14 個(gè)與其正相關(guān)，18 個(gè)與其負(fù)相關(guān)；對PC2 起主要作用的微生物PLFA 有17 個(gè)，1 個(gè)與其正相關(guān)，16 個(gè)與其負(fù)相關(guān)，有的磷脂脂肪酸之間相關(guān)性很大，幾乎集中于一條射線。裸地與種植植物樣地被明顯區(qū)分開，裸地位于PC2 軸的正向，種植植物樣地均位于PC2 軸的負(fù)向，費(fèi)菜樣地和田菁樣地均位于PC1 軸的負(fù)向，蒲公英樣地位于PC1 軸的正向，說明裸地與種植植物樣地的土壤微生物PLFA 組成存在較大差異，蒲公英樣地與費(fèi)菜樣地、田菁樣地的土壤微生物組成有一定差異，但費(fèi)菜與田菁樣地土壤微生物相似性較高。因此，主成分分析結(jié)果也證明了種植3 種耐鹽植物對土壤微生物群落有較大影響，不同植物品種覆蓋的土壤微生物組成也略有不同。

表2 不同處理樣地土壤的化學(xué)性質(zhì)Table 2 Soil chemical properties under different treatments

表3 不同處理土壤微生物PLFA含量（nmol·g-1）Table 3 Soil microbial PLFA content under different treatments（nmol·g-1）

表4 不同處理土壤微生物群落多樣性Table 4 Diversity of soil microbial community under different treatments

圖1 不同處理土壤微生物PLFA主成分分析Figure 1 PCA of soil microbial PLFA under different treatments

3 討論

植物、土壤和微生物是相互作用的有機(jī)整體。土壤微生物與地上植物息息相關(guān)，地上植物會直接或間接地影響土壤微生物量、活動和組成，而土壤微生物又會反過來影響地上植物生長。已有研究表明，植被的類型、數(shù)量及種植年限顯著影響土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)[30-32]。本研究分析了種植3種耐鹽植物對濱海鹽土化學(xué)性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，種植植物樣地土壤電導(dǎo)率和速效鉀含量顯著下降，有機(jī)質(zhì)和有效磷含量卻顯著升高，微生物群落組成也發(fā)生改變。這可能是種植植物后，土壤覆蓋度好，蒸發(fā)量小，而且耐鹽植物的生長還可以有選擇地吸收一些鹽離子，尤其是通過吸收較多鉀離子來抵御鹽土環(huán)境脅迫，使得土壤電導(dǎo)率和速效鉀含量下降；另外植物凋落物歸還土壤中，可以增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，進(jìn)而使土壤電導(dǎo)率降低，而有機(jī)質(zhì)含量的增加又為土壤微生物生長提供了充足的碳源，更利于多種微生物的繁殖和活動，同時(shí)微生物的增加又可以促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分釋放，使得土壤有效磷含量也升高。因此種植耐鹽植物能夠?qū)ν寥佬再|(zhì)改善、養(yǎng)分積累和循環(huán)起到調(diào)節(jié)作用。

土壤微生物作為植物與土壤環(huán)境之間溝通的橋梁，其必然受到植物和土壤性質(zhì)的直接影響。與裸地比較，本研究中種植植物土壤中革蘭氏陰性菌、放線菌、AM 真菌及微生物總量均升高，這可能是植物根系分泌物介導(dǎo)下，植物根際促生菌在土壤中富集的原因。另外種植植物土壤中革蘭氏陽性菌含量及G+/G-顯著降低，即細(xì)菌趨于向革蘭氏陰性菌轉(zhuǎn)變。這與王娟英等[18]、余悅[33]的研究結(jié)果一致，可能由于8月份采樣時(shí)為植物生長旺盛期，植物光合作用和生理代謝活動加強(qiáng)，根系分泌物使土壤有機(jī)質(zhì)增加，而且土壤覆蓋度好，環(huán)境濕潤，更利于革蘭氏陰性菌的生長。有學(xué)者認(rèn)為[34-36]革蘭氏陰性菌類群對環(huán)境變化較敏感，但在富營養(yǎng)條件下革蘭氏陰性菌生長比革蘭氏陽性菌迅速。邢肖毅[37]研究表明，土壤中G+/G-比值越小，F(xiàn)/B值越大，土壤肥力越高。而本研究中植物樣地土壤G+/G-降低，F(xiàn)/B 增加，也說明了種植耐鹽植物后土壤養(yǎng)分逐漸增加，給微生物生長提供充足的碳源，更有利于微生物的繁殖，同時(shí)微生物的增加又可以促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分釋放，對土壤性質(zhì)改善、養(yǎng)分積累和循環(huán)起調(diào)節(jié)作用。

PLFA 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于土壤、堆肥樣品、湖泊、海洋沉積物等環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究中，但也存在不足之處，如對特異性微生物類群的鑒定不夠準(zhǔn)確[38]，另外在磷脂脂肪酸鑒定過程中，盡管操作規(guī)范嚴(yán)格，但實(shí)際操作過程中仍會出現(xiàn)一些偏差，這些因素都會影響脂肪酸組成和含量的檢測準(zhǔn)確性[39]。為了更全面、更深入地了解耐鹽植物種植對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，應(yīng)結(jié)合高通量測序技術(shù)進(jìn)行分析。

4 結(jié)論

（1）在濱海鹽土環(huán)境下，種植費(fèi)菜、田菁和蒲公英3 種耐鹽植物，不僅可以降低濱海鹽土土壤電導(dǎo)率，提高有機(jī)質(zhì)和有效磷含量，還能夠增加土壤中革蘭氏陰性菌、放線菌、AM 真菌、真核生物、真菌的數(shù)量，而且能提高土壤微生物多樣性，改善土壤微生態(tài)環(huán)境。

（2）費(fèi)菜在降低濱海鹽土土壤電導(dǎo)率方面效果明顯，蒲公英在提高土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷含量及微生物群落多樣性方面占優(yōu)勢。因此通過種植費(fèi)菜和蒲公英能夠改良濱海鹽土。

本研究結(jié)果為植物修復(fù)河北濱海鹽土提供了理論依據(jù)。