高 璠，汪 鑫，楊 冉，田月新，苗心妍，封曉娟，劉淑霞

(1.河北醫(yī)科大學教學實驗中心，河北 石家莊 050017；2.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科,河北 石家莊 050000；3.河北省中醫(yī)院病理科,河北 石家莊 050000；4.河北醫(yī)科大學病理學教研室，河北 石家莊 050017)

狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是系統(tǒng)性紅斑狼瘡( systemic lupus erythematosus，SLE)的常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率很高且治愈率很低，一直是SLE患者的主要死因之一，因此探明 LN的發(fā)病機制，以期為探索有效的LN治療靶點提供堅實的實驗理論依據(jù)尤為重要。在臨床上狼瘡性腎炎患者的病理呈現(xiàn)出多樣性，腎小球內(nèi)皮細胞及系膜細胞的過度增殖，炎細胞浸潤，新月體形成等均是LN活動期主要病理改變及評分依據(jù)，細胞外基質(zhì)沉積則是狼瘡性腎炎向終末期進展的主要原因之一，由細胞外基質(zhì)沉積導(dǎo)致的多數(shù)腎小球發(fā)生硬化是LN腎臟病理損傷的終末階段及主要死因。因此，在本研究探討了LN腎小球細胞增殖和細胞外基質(zhì)的發(fā)病機制。

細胞的增殖活性主要受細胞周期蛋白及其依賴性激酶調(diào)控，而在多種疾病中發(fā)現(xiàn)細胞因子是通過調(diào)控細胞周期蛋白及其依賴性激酶來介導(dǎo)細胞的增殖水平從而參與疾病發(fā)生的，我們前期實驗[1-2]已經(jīng)證實，重組高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)蛋白能夠顯著上調(diào)人腎小球系膜細胞(human mesangial cell，HMC)的增殖水平，而通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制MRL/ lpr小鼠腎臟組織中HMGB1蛋白的表達則可部分減緩小鼠腎小球細胞數(shù)目的增多及系膜區(qū)的增寬。

系膜區(qū)增寬是腎小球硬化的形態(tài)學表現(xiàn)之一，腎小球硬化細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)過度沉積則是其發(fā)生的病理學基礎(chǔ)，其主要過程可能是腎小球系膜區(qū)及毛細血管袢血管壁基底膜部位包括Ⅳ型膠原蛋白(typeⅣ collagen，collagenⅣ)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、蛋白多糖、糖胺聚糖等膠原蛋白和非膠原糖蛋白合成增多或降解減少造成的。腎小球系膜細胞是參與ECM過度沉積的主要細胞。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1參與多種疾病的纖維化或硬化進程，那么HMGB1是否與LN的細胞外基質(zhì)沉積相關(guān)，其機制如何？一旦被分泌至胞外，HMGB1大多情況下是作為DAMP與靶細胞細胞膜受體相互結(jié)合從而進一步激活靶細胞內(nèi)下游的信號通路，以介導(dǎo)疾病的發(fā)生。Toll樣受體2(Toll like receptor 2，TLR2)、Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)和RAGE是最早發(fā)現(xiàn)也是最常見的HMGB1相關(guān)受體，我們前期實驗已證實TLR2介導(dǎo)了HMGB1誘導(dǎo)的LN中細胞增殖，TLR4與HMGB1所誘導(dǎo)的系膜細胞增殖關(guān)系如何？HMGB1是否通過與TLR4結(jié)合介導(dǎo)LN的腎小球細胞外基質(zhì)沉積？

綜上所述，我們前期實驗已經(jīng)證實，HMGB1參與了LN系膜細胞增殖，但其具體機制如何？且其是否參與了腎小球細胞外基質(zhì)沉積目前尚不清楚。因此我們開展此項研究，通過以LN患者腎穿標本，MRL/ lpr小鼠和HMC細胞系為研究對象，LN患者置換血漿和重組 HMGB1為刺激物，檢測系膜細胞中TLR4的表達水平變化及其與 HMGB1所誘導(dǎo)的系膜細胞增殖和ECM沉積的關(guān)系，探討HMGB1是否激活TLR4以介導(dǎo)LN發(fā)病中腎小球系膜細胞的增殖和細胞外基質(zhì)沉積的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗試劑 小鼠抗單克隆β-actin抗體(HRP-60008)購買于proteintech公司；人FN ELISA試劑盒(ab219046)、Cell Counting試劑盒8(CCK-8) (ab228554)、兔多克隆TLR4抗體(ab13556)、兔多克隆FN抗體(ab268021)均購買于Abcam公司；TAK242(614316)、甘草酸(glycyrrhizic，Gly)(G2137)購自Sigma公司。HMGB1、Gly及TAK242以細胞培養(yǎng)基稀釋后使用濃度為100 μg ·L-1、2 mmol·L-1和1 mmol·L-1。

1.1.2腎穿標本 收集2016年1月-2018年12月期間由河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科及腎內(nèi)科收治的狼瘡性腎炎患者的腎穿石蠟標本，共計30例，所有患者均為初治且診斷明確，符合美國風濕病協(xié)會制定的SLE的診斷標準，且患者24 h尿蛋白定量>0.5 g或者連續(xù)兩次尿蛋白定量>1+。同時，收集該期間由河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科收治的腎臟腫瘤患者腫瘤組織旁5 cm以外正常腎組織20例設(shè)置為對照組。研究中尊重受試者的自主意愿，遵守無風險、不傷害以及公正的原則，同時對受試者個人信息及相關(guān)資料的保密措施。

1.1.3實驗動物 30周齡MRL/lpr雌性小鼠10只，體質(zhì)量(30～35) g，設(shè)為狼瘡性腎炎模型組，同周齡同體重MRL/MPJ小鼠10只設(shè)為對照組，小鼠均由北京維通利華實驗動物科技有限公司代購自美國Jackson實驗室(實驗動物編號為000485、000486)。實驗動物在SPF級實驗動物飼養(yǎng)室進行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為每籠5只，溫度為(22±2) ℃，相對濕度為(55±2)%，各項操作符合河北醫(yī)科大學實驗動物飼養(yǎng)管理條例。

1.1.4細胞 人系膜細胞系(HMC)購買于中南大學高等研究中心現(xiàn)代分析測試中心細胞室。

1.1.5LN患者置換血漿 收集河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科和腎內(nèi)科LN患者置換血漿5例。研究中尊重受試者的自主意愿，遵守無風險、不傷害以及公正的原則，同時對受試者個人信息及相關(guān)資料的保密措施。

1.2 儀器光學顯微鏡(日本Olympus)，全自動多功能酶標儀(美國Thermo Scientific)，Odyssey FC成像儀(美國Li-COR Biosciences)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，超低溫冰箱(青島Haier)，石蠟包埋機(德國LEICA)，石蠟切片機(德國LEICA)，臺式高速低溫離心機(德國Eppendorf)，垂直電泳槽(美國Bio-Rad)，轉(zhuǎn)移電泳儀(美國Bio-Rad)，轉(zhuǎn)移電泳槽(美國Bio-Rad)。

1.3 方法

1.3.1細胞分組

1.3.1.1 生長狀態(tài)良好的人系膜細胞 HMC隨機分為對照血漿刺激組組、LN患者血漿刺激組和LN患者血漿+Gly組(Gly預(yù)孵育4H后加入LN患者血漿)，根據(jù)MTT結(jié)果LN患者血漿濃度選擇5%～10%，LN患者血漿刺激48 h后收取細胞及細胞培養(yǎng)上清，采用ELISA技術(shù)檢測HMC細胞培養(yǎng)上清中FN蛋白水平。

1.3.1.2 生長狀態(tài)良好的人系膜細胞 HMC隨機分為HMGB1時間梯度刺激組(0、10、20、30、40、50 min)，收取細胞蛋白，Western blot檢測細胞中TLR4和Myd88蛋白的表達水平變化。

1.3.1.3 生長狀態(tài)良好的人系膜細胞 HMC隨機分為對照組、HMGB1刺激組和HMGB1+TAK242刺激組(TAK242預(yù)孵育1 h后加入HMGB1)，①HMGB1刺激12 h后收取細胞，CCK8試劑盒檢測細胞增殖水平；②HMGB1刺激48 h后收取細胞及細胞培養(yǎng)上清，Western blot技術(shù)檢測細胞中FN表達水平， ELISA技術(shù)檢測HMC細胞培養(yǎng)上清中FN蛋白水平。

1.3.2ELISA技術(shù) 檢測人系膜細胞培養(yǎng)上清FN蛋白水平：嚴格按照說明書要求稀釋標準蛋白制作梯度標準蛋白，后將實驗樣品及稀釋好的標準蛋白加入96孔板中，同時每孔均設(shè)立2個復(fù)孔； 每孔加50 μL Antibody Cocktail，覆膜后置于37 ℃搖床1 h；加入1× Wash buffer 350 μL后,重復(fù)洗板3次并加入底物溶液(100μL/每孔)37 ℃孵育15 min；終止液100 μL以終止反應(yīng)，使用酶標儀在OD 450 nm處檢測標本IOD值；根據(jù)說明書及酶標儀讀數(shù)繪制標準蛋白的標準曲線并計算出實驗樣品的蛋白濃度。

1.3.3免疫組織化學技術(shù) 檢測對照組和LN患者腎穿標本腎小球細胞中TLR4蛋白表達水平：腎組織常規(guī)脫蠟至水；配置枸櫞酸修復(fù)液，高壓5 min進行抗原修復(fù)并自然晾涼；過氧化氫37 ℃避光孵育20 min去除內(nèi)源性過氧化物酶； 山羊血清于37 ℃孵育60 min進行封閉；滴加抗TLR4抗體(1 ∶200稀釋)，4 ℃過夜；二抗室溫孵育30 min；三抗室溫孵育30 min；DAB進行顯色；蒸餾水終止顯色；應(yīng)用蘇木精進行復(fù)染，應(yīng)用1%鹽酸酒精進行分化，氨水進行返藍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并在光學顯微鏡下觀察及拍照。

1.3.4Western blot技術(shù) 檢測人系膜細胞中的TLR4和Myd88蛋白的水平：收集蛋白并應(yīng)用BCA法定量，使用30 μg蛋白通過煮沸10 min變性，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；90 V恒壓濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入FN(1 ∶1 000)TLR4(1 ∶1 000)、Myd88(1 ∶1 000)和β-actin抗體(1 ∶1 000) 并于4 ℃冰箱搖床過夜；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠 IgG，37 ℃孵育1 h，HRP法化學發(fā)光，使用Odyssey FC成像系統(tǒng)顯影并照相，Gel-Pro analyzer進行定量分析，目的蛋白與β- actin的IOD的比值代表目的蛋白的相對表達量。

1.3.5免疫細胞化學技術(shù) 檢測MRL/MPJ小鼠和MRL/lpr小鼠腎小球原代系膜細胞中TLR4蛋白表達水平：篩網(wǎng)法提取兩組小鼠腎小球組織，將腎小球懸液加入到預(yù)包被膠原蛋白Ⅰ的培養(yǎng)瓶中，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)細胞72 h后進行胰酶消化，繼續(xù)培養(yǎng)至10 d左右不規(guī)則的系膜細胞為主要細胞，收集細胞，4%多聚甲醛固定；3% H2O2甲醇孵育；山羊血清封閉30 min；滴加TLR4抗體(1 ∶200)冰箱4 ℃過夜；后同“1.2.3”。

1.3.6CCK-8技術(shù) 檢測HMC的增殖水平： 接種細胞懸液100 μL于96孔板，預(yù)先置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；在每孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑，把培養(yǎng)板放置培養(yǎng)箱內(nèi)2.5 h；在450 nm波長處測定吸光值。

1.3.7統(tǒng)計學分析 實驗結(jié)果均應(yīng)用SPSS 15.0進行統(tǒng)計學分析，實驗中計量資料分析應(yīng)用獨立樣本t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗。

2 結(jié)果

2.1 LN患者腎小球細胞TLR4蛋白表達上調(diào)免疫組化結(jié)果顯示，TLR4蛋白在LN患者腎穿標本腎小球細胞中的表達較為明顯，陽性信號主要定位于腎小管上皮細胞以及腎小球細胞的胞核和胞質(zhì)，而在癌旁遠端正常腎組織腎小球細胞中無明顯表達(Fig 1)。

Fig 1 Expression of TRL4 in renal biopsy of LN patients and peri-cancer remote tissues detected by immunohistochemistry *P<0.05 vs control group，bar=50 μm

2.2 原代MRL/lpr小鼠腎小球系膜細胞中TLR4表達水平上調(diào)免疫細胞化學結(jié)果顯示，TLR4在原代MRL/MPJ小鼠和MRL/lpr小鼠腎小球系膜細胞中均表達于細胞質(zhì)和細胞膜，而與對照小鼠相比，MRL/lpr小鼠系膜細胞中TLR4的表達水平明顯增強，主要定位于腎小球細胞的胞膜及胞質(zhì)(Fig 2)。

2.3 Gly部分阻斷HMGB1誘導(dǎo)的HMC培養(yǎng)上清中的FN表達水平的上調(diào)ELISA檢測結(jié)果提示，HMGB1刺激組HMC培養(yǎng)上清中的FN水平較正常對照組明顯升高；與HMGB1刺激組相比， HMGB1+ Gly組HMC的培養(yǎng)上清中FN蛋白水平降低(Fig 3)。

Fig 2 Expression of TRL4 in primary mesangial cells of MRL/MPJ mice and MRL/lpr mice detected by

Fig 3 Expression of FN in culture supernatant of

2.4 HMGB1活化HMC的TLR4/Myd88信號通路Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，HMGB1刺激HMC 20 min后，TLR4和Myd88蛋白表達水平上調(diào)并逐漸增高，HMGB1刺激50 min后TLR4表達降低至正常水平(Fig 4)。

Fig 4 Expression levels of TLR4 and Myd88 in HMCs

2.5 TAK242部分阻斷 HMGB1誘導(dǎo)的HMC中FN蛋白表達水平的上調(diào)Western blot結(jié)果顯示，F(xiàn)N蛋白在HMGB1刺激組HMC中的蛋白表達水平較正常對照組明顯上調(diào)；而與HMGB1刺激組相比，HMGB1+TAK242組HMC中FN蛋白表達水平下降(Fig 5)。

2.6 TAK242部分阻斷HMGB1誘導(dǎo)的HMC培養(yǎng)上清中的FN表達水平的上調(diào)ELISA檢測結(jié)果提示，HMGB1刺激組HMC培養(yǎng)上清中的FN水平較正常對照組明顯升高；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+ TAK242組HMC的培養(yǎng)上清中FN蛋白水平降低(Fig 6)。

2.7 TAK242部分阻斷HMGB1誘導(dǎo)的HMC增殖水平的上調(diào)CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，HMGB1刺激組HMC的細胞增殖水平明顯升高；與HMGB1刺激組相比，HMGB1+TAK242組HMC的細胞增殖水平下調(diào)(Fig 7)。

3 討論

腎臟組織的病理學改變是腎功能損傷的形態(tài)基礎(chǔ)，LN患者的腎臟病理表現(xiàn)多種多樣，腎小球內(nèi)皮細胞和系膜細胞過度增殖，基底膜纖維素樣壞死，腎小球細胞外基質(zhì)沉積，腎小管上皮細胞損傷等均參與了腎小球濾損傷的形成，其中腎小球細胞過度增生是LN活動期的主要腎小球病理學改變，細胞外基質(zhì)沉積則是LN腎小球腎炎進展的終末階段的主要表現(xiàn)之一[3]，因此，本文旨在探明系膜細胞增生及細胞外基質(zhì)沉積的發(fā)生機制，為LN的靶向治療提供堅實的理論依據(jù)。

Fig 5 Expression of FN in HMCs detected

Fig 6 Expression of FN in culture supernatant of HMCs

我們的前期實驗圍繞著HMGB1在LN中的作用機制進行了探討。HMGB1已被多項研究的證實可作為炎癥因子或通過模式識別受體途徑參與LN的進程，但其具體機制不明。研究證實[4]，與無腎臟損傷的SLE患者相比，LN患者外周血和尿液中所分離的MPs中 HMGB1的表達均明顯升高，且尿液中HMGB1的水平與SLEDAI評分呈正相關(guān)，研究還證實HMGB1在LN患者腎組織中細胞質(zhì)的表達水平升高。我們在前期實驗中[2,5]使用原位電轉(zhuǎn)技術(shù)，降低MRL/lpr小鼠腎臟中 HMGB1蛋白表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠尿蛋白水平及腎臟病理改變減輕，腎小球細胞數(shù)目增多得到緩解，提示我們在LN發(fā)病過程中，HMGB1可能通過促進內(nèi)皮細胞和系膜細胞增殖參與了蛋白尿的形成，在本實驗中我們同樣發(fā)現(xiàn)，HMGB1刺激HMC以后48H細胞的增殖水平增高。

Fig 7 HMC proliferation detected by CCK-8

同時還有研究發(fā)現(xiàn)LNⅤ型患者尿液中HMGB1水平明顯上調(diào)[6]，提示了HMGB1細胞外基質(zhì)沉積的可能關(guān)系，因此我們推測HMGB1可能還與LN發(fā)生中細胞外基質(zhì)沉積相關(guān)。而ECM過度沉積是腎小球硬化發(fā)生的病理學基礎(chǔ)，這可能是由Ⅳ型膠原蛋白(typeⅣ collagen，collagenⅣ)、纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、蛋白多糖、糖胺聚糖等膠原蛋白和非膠原糖蛋白合成增多或降解減少造成的[7]。ECM過度沉積過程受到多種機制調(diào)控，如TGF-β[8]及IL[7]可作用于腎小球細胞，導(dǎo)致腎小球硬化，TGF-β還被證實介導(dǎo)細胞外基質(zhì)的沉積。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1也與細胞外基質(zhì)釋放相關(guān)[9-10]。我們在本研究中首先使用LN患者置換血漿作用于HMC，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LN患者置換血漿可以上調(diào)人系膜細胞中的FN分泌，而當我們同時使用了甘草酸后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LN患者置換血漿所誘導(dǎo)的FN表達和分泌增加的現(xiàn)象受到了部分抑制，因此我們考慮，HMGB1在LN發(fā)病過程中參與了系膜細胞FN的表達與分泌，我們考慮LN患者置換血漿中細胞因子種類繁多，除HMGB1外，其他細胞因子可能也參與這一過程，因此甘草酸的對LN患者置換血漿所引起的系膜細胞的FN蛋白的分泌僅表現(xiàn)部分抑制。接下來我們對HMGB1參與LN系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)沉積的具體作用機制進行了探討。

胞外的HMGB1需與其受體結(jié)合，以激活細胞內(nèi)相關(guān)信號途徑，參與其致炎作用[11]。我們的前期實驗分別檢測了LN患者腎組織相關(guān)受體的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁遠端正常組織相比，LN患者腎小球細胞中RAGE、TLR2、TLR4及TLR6的表達水平均出現(xiàn)不同程度的升高，我們推測，HMGB1通過與不同受體結(jié)合，激活不同信號通路，參與了LN進程中的多種病理性損傷。而以往研究發(fā)現(xiàn)TLR4可通過被其配體識別，進而通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，Myd88)依賴性信號通路或非經(jīng)典信號通路，Myd88通常通過IKKs激活NFkB，使其從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞核，最終引起大量炎性因子合成上調(diào)，最終打破細胞內(nèi)促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)的平衡。已有研究證實，TLR4通過激活KLF/NF-kB信號通路參與PA(palmitic acid)介導(dǎo)的脂肪細胞IL-1的分泌[12]，HMGB1通過與RAGE或TLR2/TLR4結(jié)合參與Obstructive sleep apnea,OSA缺氧環(huán)境所誘導(dǎo)的腎損傷[13-16],TLR4抑制劑TAK242通過抑制HMGB1誘導(dǎo)的PASMCs的Ca2+通道的活化[10]。在本研究中，我們用TLR4抑制劑TAK242處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HMGB1處理組相比，系膜細胞培養(yǎng)上清中的FN蛋白表達水平降低，提示TLR4可能參與了HMGB1誘導(dǎo)的系膜細胞的細胞外基質(zhì)沉積。而CCK8檢測結(jié)果則提示TAK242能夠改善HMGB1誘導(dǎo)的系膜細胞的過度增殖。由此我們得出結(jié)論，TLR4參與了HMGB1誘導(dǎo)的系膜細胞的過度增殖及細胞外基質(zhì)沉積進程。

綜上所述，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，LN患者外周血中可能存在HMGB1的過度分泌，而HMGB1蛋白可通過識別并結(jié)合與腎小球系膜細胞表面的TLR4受體結(jié)合，進而促進系膜細胞過度增殖，以及FN和Col Ⅳ等細胞外基質(zhì)成分的沉積，從而介導(dǎo)了LN發(fā)病過程中腎小球細胞數(shù)目增多，腎小球硬化等病理進程。