李雪茹 徐衛(wèi)華 范曉晨

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，合肥 230022)

巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于皰疹病毒β亞科，可以長(zhǎng)期潛伏于人體的血液、尿液、乳汁等體液中，通過(guò)輸血、呼吸道、垂直途徑等多種方式傳播[1]。CMV在人群中存在普遍感染，且大多數(shù)感染呈隱性感染或潛伏感染，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，再活化感染[2]。然而，嬰幼兒CMV感染常表現(xiàn)出肺、肝、腦等多臟器損傷，且年齡越小，顯性感染患者所占比例越多，這可能與嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚不完善有關(guān)[3]。多項(xiàng)研究顯示，CMV感染可引起宿主免疫器官損傷，機(jī)體免疫力下降，激活潛伏病毒，引起多臟器功能損傷[4-5]。T淋巴細(xì)胞亞群是介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群，可分泌多種細(xì)胞因子，參與了CMV感染的發(fā)生發(fā)展，但T淋巴細(xì)胞亞群變化與CMV感染患兒臨床癥狀及載毒量之間的關(guān)系研究報(bào)道較少[6]。因此，本研究采用流式細(xì)胞技術(shù)分析了CMV感染患兒的T淋巴細(xì)胞亞群，旨在探討細(xì)胞免疫與CMV感染發(fā)病之間的關(guān)系，為CMV感染患兒的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選擇2015年6月至2019年5月在本院確診的97例CMV感染患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合2012年《兒童巨細(xì)胞病毒性疾病診斷和防治的建議》中CMV感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，尿液聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)顯示CMV DNA陽(yáng)性；均獲得患兒家屬知情同意，經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)通過(guò)。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天氣道發(fā)育畸形、呼吸道異物等疾病。CMV感染組根據(jù)有無(wú)癥狀分為癥狀組(60例)和無(wú)癥狀組(37例)，癥狀組男32例，女28例，年齡1～12個(gè)月，平均(5.89±1.76)個(gè)月，臨床癥狀：28例表現(xiàn)為肺炎，23例表現(xiàn)為單純肝功能損害，3例表現(xiàn)為黃疸合并肝功能損害，4例表現(xiàn)為聽(tīng)力受損，2例表現(xiàn)為血小板減少；無(wú)癥狀組男20例，女17例，年齡1～12個(gè)月，平均(5.94±1.78)個(gè)月，表現(xiàn)為無(wú)癥狀性感染。選擇同期健康體檢嬰兒48例為對(duì)照組，對(duì)照組男26例，女22例，年齡1～12個(gè)月，平均(5.92±1.80)個(gè)月。3組年齡、性別等一般資料無(wú)顯著差異(P>0.05)。

1.1.2儀器和試劑 FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD Biosciences公司提供；淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)抗體抗CD3-FITC、CD4-APC、CD8-PE購(gòu)自美國(guó)BD Multitest公司；IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；CMV病毒定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海羽朵生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測(cè)尿液CMV DNA 取所有患兒的1 ml尿液標(biāo)本，離心(15 000 r/min，15 min)，采用煮沸法提取尿液DNA，CMV檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2外周血標(biāo)本采集 清晨采集CMV感染患兒以及健康體檢者靜脈血2 ml，用乙二胺四乙酸抗凝，一份離心(3 000 r/min，10 min)，取血漿置-80℃冰箱凍存，采用ELISA法用于檢測(cè)IL-6、IL-10、TNF-α水平；另一份直接用于流式細(xì)胞儀分析。

1.2.3流式細(xì)胞儀分析T淋巴細(xì)胞亞群 取20 μl抗凝血，加入紅細(xì)胞裂解液溶解紅細(xì)胞，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加 PBS 重懸細(xì)胞，分別加入5 μl熒光標(biāo)記抗體FITC anti-human CD3、熒光標(biāo)記抗體anti-human CD4 APC、熒光標(biāo)記抗體anti-human CD8 PE，分別以FITC、APC和PE作為同型對(duì)照，振蕩混勻，室溫避光孵育15～20 min，加入PBS 2 ml，離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，取200 μl置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1CMV感染患兒尿液中CMV DNA載量 癥狀組CMV感染患兒尿液中CMV DNA載量明顯高于無(wú)癥狀組CMV感染患兒(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群 與對(duì)照組相比，CMV感染患兒有癥狀組和無(wú)癥狀組外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+細(xì)胞水平均明顯降低 (P<0.05)， 有癥狀組外周血CD3+CD8+T細(xì)胞水平明顯升高(P<0.05)；與CMV感染患兒無(wú)癥狀組相比，CMV感染患兒有癥狀組外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平均明顯降低(P<0.05)，CD3+CD8+T明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1，表2。

表1 CMV感染患兒尿液中CMV DNA載量

2.3CMV感染患兒血漿細(xì)胞因子水平 與對(duì)照組相比，CMV感染患兒有癥狀組和無(wú)癥狀組血清IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)，與CMV感染患兒無(wú)癥狀組相比，有癥狀組血清IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群與細(xì)胞因子之間的相關(guān)性 CMV感染患兒外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+細(xì)胞水平均與IL-6、IL-10和TNF-α水平呈顯著的負(fù)相關(guān)(P<0.05)，CD3+CD8+T細(xì)胞水平均與IL-6、IL-10和TNF-α水平呈顯著的正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.5CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群與CMV DNA載量之間的相關(guān)性 CMV感染患兒外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+細(xì)胞水平均與CMV DNA載量呈顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.295，-0.443，-0.328，P<0.05)，CD3+CD8+T細(xì)胞水平與CMV DNA載量呈顯著的正相關(guān)(r=0.224，P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖1 CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群Fig.1 T lymphocyte subsets in peripheral blood of children with CMV infectionNote:A.Symptom group;B.Asymptomatic group;C.Control group.

表2 CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群

表3 CMV感染患兒血漿細(xì)胞因子水平

表4 CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群與細(xì)胞因子之間的相關(guān)性(r，n=97)

圖2 CMV感染患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群與CMV DNA載量之間的相關(guān)性Fig.2 Correlation between peripheral blood T lymphocyte subsets and CMV DNA load in children with CMV infection

3 討論

CMV感染在大部分人群中呈陰性感染，但在部分免疫功能低下者(胎兒和新生兒、先天性免疫缺陷病等)中可引起危及生命的病變，嚴(yán)重危害了患兒的生命健康[8]。本研究分析了CMV患兒的病毒載量與臨床癥狀之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CMV感染有癥狀的患兒尿液中的載毒量明顯高于無(wú)癥狀患兒，提示CMV患兒的病毒載量直接影響了病情發(fā)展和臨床癥狀。目前，CMV感染的治療主要采用營(yíng)養(yǎng)支持、抗病毒治療以及對(duì)癥治療，但其治療效果并不十分滿(mǎn)意[9]。分析CMV感染的發(fā)病機(jī)制，對(duì)CMV感染的預(yù)防和治療具有重要意義。

已有多項(xiàng)研究顯示，CMV感染可引起T細(xì)胞亞群及輔助性T細(xì)胞1(helper T cells 1，Th1)和Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子比例失衡，從而引起機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能紊亂，導(dǎo)致各臟器功能出現(xiàn)一系列損傷[10-11]。本研究分析了CMV患兒的T淋巴細(xì)胞亞群水平，發(fā)現(xiàn)CMV感染患兒的CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平均明顯降低，且有癥狀組較無(wú)癥狀組下降更為明顯，提示CMV感染患兒的T淋巴細(xì)胞亞群變化與CMV感染的病情發(fā)展有關(guān)。T淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞群體，按功能可分為輔助性T細(xì)胞(T helper cells，Th)、記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T cells，Tc)和抑制性T細(xì)胞(suppressor T cell，Ts)[12]。CD4+T 細(xì)胞主要為T(mén)h細(xì)胞，CD8+T分布于Tc細(xì)胞及Ts細(xì)胞表面，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[13-14]。Th細(xì)胞包括Th1、Th2、Th17等，可以分泌IL-6、IL-10、TNF-α/TNF-β等多種細(xì)胞因子，促進(jìn)其他T細(xì)胞的分化成熟，還可以輔助B細(xì)胞分化為抗體分泌細(xì)胞，參與細(xì)胞免疫和體液免疫的調(diào)節(jié)，Tc細(xì)胞可以直接清除病毒、腫瘤等靶細(xì)胞，Ts細(xì)胞則能抑制Th細(xì)胞，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫功能[15]。徐玲等[16]的研究顯示，CMV感染患兒存在細(xì)胞免疫功能紊亂，本研究結(jié)果與其基本一致，提示細(xì)胞免疫功能下降與CMV感染的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN- γ和TNF-α/TNF-β等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)[17]。本研究中，CMV感染患兒的血清IL-6、IL-10和TNF-α水平均明顯升高，且有癥狀組較無(wú)癥狀組升高更為明顯。ORCIANI等[18]的研究顯示，IL-6和IL-10是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在維持機(jī)體正常的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)其水平升高可拮抗Th1功能，抑制細(xì)胞免疫。TNF-α是由Th1細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，可以激活T細(xì)胞，刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，當(dāng)其水平升高可影響全身炎癥反應(yīng)，引起機(jī)體各組織器官損傷[19]。LIMAYE等[20]的研究顯示，CMV感染患兒體內(nèi)的細(xì)胞因子分泌紊亂可推進(jìn)CMV感染病情發(fā)展，進(jìn)一步引起肝腎等組織臟器損傷的主要因素，提示CMV感染的發(fā)生與細(xì)胞因子失衡密切相關(guān)。本研究中，CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平均與血清IL-6、IL-10和TNF-α有關(guān)，提示CMV感染患兒的病情發(fā)展主要由于細(xì)胞免疫功能下降引起的細(xì)胞因子分泌異常，臨床需根據(jù)提高CMV感染患兒的細(xì)胞免疫功能，糾正細(xì)胞因子分泌異常。本研究中，CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平與患者的CMV DNA病毒載量呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平與患者的病情發(fā)展和臨床癥狀有關(guān)，臨床可根據(jù)患者的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平，正確評(píng)估患者的病情發(fā)展，及早做好預(yù)防和治療措施。

綜上所述，CMV感染患兒的外周血CD3+T、CD3+CD4+T和CD4+/CD8+水平明顯下降，且其下降水平與細(xì)胞因子水平和CMV DNA病毒載量顯著相關(guān)，有望應(yīng)用于指導(dǎo)臨床預(yù)防和治療工作的進(jìn)行。