夏儒銳 梁培育 王聲興 歐善際 彭曉暉

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，?？?570102)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，以膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)最為常見，其易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性及術(shù)后并發(fā)癥導(dǎo)致患者生存質(zhì)量降低，患者5年生存率低于15%[1]。研究其發(fā)展的分子機制對疾病的靶向治療極其重要。研究表明，lncRNA和miRNA在可作為預(yù)測BUC患者生存和預(yù)后的獨立標(biāo)志物[2-3]。有報道，lncRNA HOXA11-AS(homeobox A11-antisense RNA)在肝癌組織、骨肉瘤組織和細胞及口腔鱗狀細胞癌組織中高表達，其過表達可促進口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖，抑制其表達可抑制肝癌和骨肉瘤細胞的遷移和侵襲能力[4-6]。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-515-5p可能是lncRNA HOXA11-AS的靶基因。MiR-515-5p在前列腺癌、非小細胞肺癌和胃癌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-515-5p可抑制癌細胞的增殖或轉(zhuǎn)移[7-9]。但lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC中的表達、對癌細胞的影響及兩者的關(guān)系目前還尚未可知。本研究探尋HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC細胞增殖、遷移、侵襲中的作用機制，以期為BUC的診斷治療提供新的分子生物學(xué)靶點。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本 選取2016年6月至2017年12月于本院病理檢查確診為BUC的患者手術(shù)切除的BUC組織及癌旁組織(距離BUC組織邊緣>1.5 cm)各20例，男16例，女4例，年齡26～80歲，平均年齡(49.5±16.6)歲，按照2006年WHO標(biāo)準(zhǔn)分類，浸潤性14例，非浸潤型6例。所有患者術(shù)前未接受放療和化療。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并與所有患者簽訂知情同意書。

1.1.2試劑及儀器 人BUC細胞株J82購自ATCC；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，Total RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；四氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶Trypsin購自美國Sigma-Aldrich公司；Cyclin D1、p21、p27、MMP-2、MMP-9、MMP-14和GAPDH抗體購自美國Santa公司；lncRNA HOAX11-AS抑制劑(si-HOAX11-AS)、HOAX11-AS過表達載體(pcDNA-HOXA11-AS)、miR-515-5p模擬物(miR-515-5p)、miR-515-5p模擬物(miR-515-5p)、陰性對照(si-NC、pcDNA、anti-miR-NC和miR-NC)和HOXA11-AS野生型(WT-HOXA11-AS)、突變型(MUT-HOXA11-AS)雙熒光素酶載體購自蘇州吉瑪基因公司；Transwell板購自美國Corning公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司；光學(xué)顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀、發(fā)光儀及RT-PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將J82細胞培養(yǎng)在含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的MEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件：濕度95%，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代保存。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，收集對數(shù)生長期的J82細胞，胰蛋白酶消化，將細胞稀釋為1×106個/ml，以2×105個/孔接種于6孔板，培養(yǎng)至融合度達到80%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：HOXA11-AS干擾組(轉(zhuǎn)染si-NC和si-HOXA11-AS)；miR-515-5p過表達組(轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-515-5p)；HOXA11-AS過表達組(轉(zhuǎn)染pcDNA和pcDNA-HOXA11-AS)；miR-515-5p和HOXA11-AS雙抑制組(共轉(zhuǎn)染si-HOXA11-AS+anti-miR-NC、si-HOXA11-AS+anti-miR-515-5p)，雙熒光素酶報告系統(tǒng)組(共轉(zhuǎn)染miR-NC+WT-HOXA11-AS、miR-515-5p+WT-HOXA11-AS、miR-NC+MUT-HOXA11-AS和miR-515-5p+MUT-HOXA11-AS)。轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3qRT-PCR檢測miR-515-5p和lncRNA HOXA11-AS的表達 用總RNA提取試劑盒從BUC組織、癌旁組織和培養(yǎng)的J82細胞中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，合成的cDNA檢測后于-80℃保存。取cDNA按照qRT-PCR的說明書進行反應(yīng)合成lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p，反應(yīng)程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 44 s、72℃ 30 s，45個循環(huán)；72℃延伸10 min。用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4MTT實驗測定細胞增殖 轉(zhuǎn)染48 h后，胰蛋白酶消化J82細胞，離心后培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞稀釋濃度為1×105個/ml，以200 μl/孔接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)至24 h、48 h和72 h時，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值。

1.2.5Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 遷移實驗：收集轉(zhuǎn)染后各組J82細胞，用不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)基過夜饑餓培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化細胞，用無血清培養(yǎng)基稀釋細胞為1×105個/ml。在Transwell下層培養(yǎng)孔加入500 μl含10%FBS的MEM培養(yǎng)基作為遷移趨化物，Transwell上層小室加入100 μl稀釋的J82細胞，再將上層小室放入下層培養(yǎng)孔中，置 CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，用棉簽拭去上層小室未遷移的細胞，甲醛固定遷移細胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡觀察計數(shù)遷移細胞。侵襲實驗：用4℃無血清培養(yǎng)基1∶8比例稀釋液化的Matrigel，取100 μl加入上層Transwell小室，固化，以下步驟同遷移實驗。

1.2.6雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 根據(jù)1.2.2進行J82細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的含HOXA11-AS和miR-515-5p結(jié)合位點的WT-HOXA11-AS和MUT-HOXA11-AS雙熒光素酶報告載體，分別與miR-NC或miR-515-5p共轉(zhuǎn)染J82細胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集并裂解細胞，離心收集上清，-20℃保存或根據(jù)試劑盒說明書進行操作，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 收集各組轉(zhuǎn)染的J82細胞，RIPA裂解液裂解細胞，將細胞進行破碎，收集蛋白，并進行SDS-PAGE，分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉2 h，洗膜，加入稀釋的一抗(Cyclin D1抗體1∶2 000、p21抗體1∶2 000、p27抗體1∶1 000、MMP-2抗體1∶1 000、MMP-9抗體1∶1 000、MMP-14抗體1∶2 000和GAPDH抗體1∶3 000)，4℃過夜孵育，洗膜，加入稀釋的酶標(biāo)二抗，洗膜，顯影，以為GAPDH內(nèi)參照，計算蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1lncRNA HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC中的表達 結(jié)果表明，與正常癌旁組織相比，BUC中HOXA11-AS含量顯著升高(P<0.05)，miR-515-5p的含量顯著下降(P<0.05)，見表1。

2.2干擾HOXA11-AS表達可抑制膀胱尿路上皮癌J82細胞增殖 轉(zhuǎn)染后，與si-NC組相比，si-HOX-A11-AS組的J82細胞中HOXA11-AS水平顯著下降(P<0.05)，si-HOXA11-AS組的細胞OD值在48 h、72 h均顯著下降(P<0.05)，Cyclin D1表達下降(P<0.05)，p21和p27表達升高(P<0.05)，見圖1和表2。說明干擾HOXA11-AS表達可以抑制J82細胞增殖。

2.3干擾HOXA11-AS表達可抑制膀胱尿路上皮癌J82細胞遷移、侵襲 與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組J82細胞的遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均顯著下降(P<0.05)，MMP-2、MMP-9和MMP-14含量顯著降低(P<0.05)，見圖2和表3。

2.4miR-515-5p過表達可抑制J82細胞增殖、遷移、侵襲 轉(zhuǎn)染后，與miR-NC組相比，miR-515-5p組的miR-515-5p水平顯著上升(P<0.05)，J82細胞OD值在48 h和72 h時均顯著降低(P<0.05)，遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)也顯著下降(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達降低(P<0.05)，p21表達升高(P<0.05)，見圖3和表4。

表1 HOXA11-AS和miR-515-5p在BUC和癌旁組織中的表達

圖1 增殖相關(guān)蛋白表達Fig.1 Expression of proliferation-related proteins

表2 干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖的影響

圖2 干擾HOXA11-AS表達對J82細胞遷移、侵襲的影響

圖3 miR-515-5p過表達對J82細胞增殖、遷移侵襲的影響

表3 抑制HOXA11-AS表達對J82細胞遷移、侵襲的影響

表4 miR-515-5p過表達對J82細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 HOXA11-AS的序列中含有與miR-515-5p互補的核苷酸序列Fig.4 Sequence of HOXA11-AS contains complementary nucleotide sequences with miR-515-5p

2.5lncRNA HOXA11-AS靶向調(diào)控miR-515-5p的表達 Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-515-5p的序列中含有與HOXA11-AS互補的序列，見圖4。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果如表5所示，與miR-NC對照組相比，miR-515-5p組野生型WT-HOXA11-AS的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)；而突變型MUT-HOXA11-AS的螢火蟲熒光素酶相對活性無顯著性差異。qRT-PCR結(jié)果表明，與pcDNA組相比，pcDNA-HOXA11-AS組的miR-515-5p含量顯著下降(P<0.05)；與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組的miR-515-5p水平顯著上升(P<0.05)。說明HOXA11-AS靶向負調(diào)控miR-515-5p的表達，見表6。

表5 雙熒光素酶報告實驗

表6 lncRNA HOXA11-AS調(diào)控miR-515-5p的表達

圖5 抑制miR-515-5p表達逆轉(zhuǎn)干擾HOXA11-AS表達對膀胱尿路上皮癌J82細胞增殖、遷移侵襲的作用

表7 抑制miR-515-5p表達逆轉(zhuǎn)干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移、侵襲的作用

2.6抑制miR-515-5p表達逆轉(zhuǎn)干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-NC組相比，si-HOXA11-AS組J82細胞中miR-515-5p含量顯著升高(P<0.05)，細胞OD值在48 h和72 h時顯著下降(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數(shù)下降(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9表達降低(P<0.05)，p21表達升高(P<0.05)；與si-HOXA11-AS+anti-miR-NC相比，si-HOXA11-AS+anti-miR-515-5p組J82細胞結(jié)果相反，見圖5、表7。說明抑制miR-515-5p表達逆轉(zhuǎn)干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

3 討論

HOXA11-AS是一種新發(fā)現(xiàn)的致癌lncRNA，在多種腫瘤中表達上調(diào)，是一種可預(yù)測惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物[10]。 HOXA11-AS在胃癌組織中表達上調(diào)，在體內(nèi)敲除HOXA11-AS可誘導(dǎo)胃癌細胞G0/G1期阻滯，抑制胃癌細胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。HOXA11-AS在乳腺癌組織中高表達，通過影響EMT標(biāo)志物(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)的表達，干擾其表達可抑制癌細胞侵襲和遷移[12]。HOXA11-AS在膠質(zhì)瘤組織和細胞中表達升高，通過調(diào)控miR-214-3p/EZH2軸促進膠質(zhì)瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移[13]。但其在BUC中的表達還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常癌旁組織相比，HOXA11-AS在BUC組織中表達量顯著升高，干擾HOXA11-AS表達可抑制膀胱尿路上皮癌J82細胞增殖、遷移、侵襲。HOXA11-AS在多種癌癥包括BUC中表達上調(diào)，并調(diào)控癌細胞增殖、遷移和侵襲[10]。

本研究通過Targetscan預(yù)測發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXA11-AS序列中含有與miR-515-5p互補的核苷酸序列，預(yù)示miR-515-5p可能是HOXA11-AS的靶基因。miR-515-5p在前列腺癌、非小細胞肺癌和胃癌中表達下調(diào)，與癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7-9]。miR-515-5p在乳腺癌組織中表達下調(diào)，與IGF-1R的單核苷酸多態(tài)性影響B(tài)RCA1突變攜帶者的乳腺癌風(fēng)險[14]。miR-515-5p高表達與乳腺癌和肺癌患者生存率增加有關(guān)，通過miR-515-5p/MARK4途徑調(diào)控癌細胞的遷移和侵襲[15]。miR-515-5p在BUC中的表達尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-515-5p在BUC組織中水平降低，過表達miR-515-5p可抑制J82細胞增殖、遷移、侵襲。說明miR-515-5p在BUC進展中發(fā)揮重要作用。

而雙熒光素酶報告系統(tǒng)和qRT-PCR結(jié)果顯示，HOXA11-AS靶向負調(diào)控miR-515-5p的表達；抑制miR-515-5p表達逆轉(zhuǎn)了干擾HOXA11-AS表達對J82細胞增殖、遷移、侵襲的作用，進一步證實了在BUC中兩者的調(diào)控關(guān)系。綜上，本研究闡述了在BUC細胞J82中，lncRNA HOXA11-AS靶向miR-515-5p調(diào)控腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究只進行了體外細胞的研究，后續(xù)研究會從體內(nèi)動物模型試驗著手，以期為BUC的臨床研究提供更多的數(shù)據(jù)支持，以期發(fā)現(xiàn)新的靶點。