閆圣玉 謝亞鋒 劉 英 許志杰 丁雅婷 張 僑 劉菀瑩

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院肛腸科,衡陽 421001)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是人類消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)均不斷上升[1-2]。盡管放化療的應(yīng)用可以提高保肛率，但外科手術(shù)切除仍然是直腸癌主要的治療手段[3]。隨著人們對CRC認(rèn)識的深入，有關(guān)其相關(guān)信號通路對腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的影響受到廣泛重視，為CRC的治療提供了新的思路和方法。

磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/哺乳動物雷帕霉素蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)傳導(dǎo)通路是一條與細(xì)胞分化、存活、增殖、血管生成、新陳代謝等密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，該通道的過表達(dá)常出現(xiàn)在人類惡性腫瘤中，被認(rèn)為是癌癥的主調(diào)節(jié)器[4]。有研究表明，PI3K 信號通路影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)起抑制凋亡、促進(jìn)增殖的作用，因此靶向 PI3K 途徑作為治療策略成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。

紅景天為景天科紅景天屬多年生草本或亞灌木植物，具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力及重要的開發(fā)價值，被譽(yù)為“高原人參”。紅景天苷的化學(xué)名稱為對羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，是紅景天的主要活性成分，其藥理作用多種多樣，應(yīng)用前景十分廣闊，具有抗腫瘤及增強(qiáng)免疫的功能，其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、肝腎、抗缺氧的作用也備受關(guān)注[5]。但目前尚未見到紅景天苷對人CRC治療的研究報道，本研究通過觀察紅景天苷對人CRCHT29細(xì)胞增殖、凋亡、自噬的影響，研究PI3K/Akt/mTOR通路的調(diào)控作用，為CRC的治療提供新的思路，具有一定價值。

1 材料與方法

1.1材料 HT29細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；紅景天苷(北京索萊寶生命科學(xué)公司，批號：18052106)；Hoechst 33342(美國Sigma-Aldrich公司，批號L7543)；吖啶橙染色試劑盒(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，LY294002)；胎牛血清(Biochrom公司)；P13K(1∶500)、p-P13K(1∶250)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶250)、mTOR(1∶1 000)、p-mTOR(1∶500)抗體(Cell Signaling Technology)；LC3抗體(上海賽信通生物試劑有限公司)；GAPDH抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad，型號：Chemi DocXRS+)；熒光顯微鏡(BX51，Qlympus)。

1.2方法

1.2.1HT29細(xì)胞傳代培養(yǎng) HT29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%牛血清、100 μg/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞融合至70%～80%時，0.25%胰酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng)。紅景天苷用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋并調(diào)節(jié)其終濃度為0.5、1.0、2.0 mmol/L。

1.2.2MTT法檢測紅景天苷對HT29細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期HT29細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104個/ml，接種于96 孔板，100 μl/孔，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。加入終濃度分別為0.5、1.0、2.0 mmol/L的紅景天苷設(shè)為紅景天苷組，并設(shè)不加藥物的空白對照組，各濃度設(shè)4個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入 MTT溶液(0.5 mg/ml)100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜 200 μl，振蕩10 min使藍(lán)紫色甲臜溶解，酶標(biāo)儀測定550 nm波長處各孔光吸收度(OD)，計算細(xì)胞活性(以空白孔為對照，酶標(biāo)儀讀取各孔OD值，OD值越高代表細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。)

1.2.3赫斯特染色檢測HT29細(xì)胞凋亡 將HT29細(xì)胞接種于24孔板，經(jīng)不同濃度的紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用后，4%多聚甲醛固定，每孔加入5 mg/L Hoechst33258染色10 min，PBS清洗，封片后熒光顯微鏡下觀察。凋亡細(xì)胞指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.4紅景天苷對HT29細(xì)胞LC3熒光強(qiáng)度的影響 將HT29細(xì)胞接種于24孔板(1×105個/孔)，經(jīng)不同濃度的紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)處理后，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定30 min。用含0.3%Triton X-100、1%牛血清白蛋白的PBS溶液封閉處理60 min，滴加LC3抗體，4℃孵育過夜。滴加FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h(避光)。加入適量 Hoechst33342染色10 min，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5吖啶橙染色觀察HT29細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡細(xì)胞器的累積 細(xì)胞于6孔板中爬片培養(yǎng)，經(jīng)不同濃度的紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用后，將吖啶橙(1 μg/ml)緩慢滴加至待測細(xì)胞，避光室溫染色5 min，吸除染液，PBS漂洗，每孔加適量4%多聚甲醛固定，封片后，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照存檔。

1.2.6Western blot檢測紅景天苷對PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響 取對數(shù)生長期的 HT29 細(xì)胞，采用RIPA細(xì)胞裂解液于冰浴上提取總蛋白，BCA法定量，加入loadding buffer煮沸10 min。取等量蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗4℃孵育過夜后， TBST洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌，ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1MTT檢測紅景天苷對HT29細(xì)胞增殖的影響 與對照組相比，紅景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)處理48 h、72 h后均能顯著抑制HT29細(xì)胞活力(P<0.01或P<0.001)，而紅景天苷作用24 h無明顯抑制作用(P>0.05)，見圖1。

2.2赫斯特染色檢測HT29細(xì)胞凋亡 經(jīng)1.0、2.0 mmol/L 紅景天苷處理48 h后，HT29細(xì)胞染色質(zhì)凝聚、固縮，凋亡形成。與對照組相比，紅景天苷組(1.0、2.0 mmol/L)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)，見圖2。

2.3免疫熒光染色法檢測紅景天苷誘導(dǎo)HT29細(xì)胞自噬 對照組HT29細(xì)胞質(zhì)顯LC3綠色熒光但染色較弱，且呈彌散狀，而紅景天苷組LC3染色強(qiáng)度增強(qiáng)，見圖3。

2.4吖啶橙染色觀察紅景天苷誘導(dǎo)HT29細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡細(xì)胞器的累積 對照組中只有少量紅色熒光，不同濃度紅景天苷(1.0、2.0 mmol/L)作用于HT29細(xì)胞后，隨著濃度增加，被吖啶橙著色顯紅色的酸性囊泡細(xì)胞器增加。

2.5Western blot檢測紅景天苷對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響 對照組HT29細(xì)胞中p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)較高，而各劑量紅景天苷可均抑制HT29細(xì)胞內(nèi)p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)，其中1.0、2.0 mmol/L紅景天苷組p-P13K表達(dá)較對照組下降,抑制效果明顯(P<0.05)； 2.0 mmol/L紅景天苷組p-Akt表達(dá)較對照組下降(P<0.05)；0.5、1.0、2.0 mmol/L紅景天苷組p-mTOR表達(dá)較對照組均下降(P<0.01)，見圖5。

圖1 不同濃度紅景天苷對HT29細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of salidroside at different concentrations on proliferation of HT29 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖2 赫斯特染色檢測紅景天苷對HT29細(xì)胞凋亡的影響

圖3 紅景天苷誘導(dǎo)自噬泡的形成Fig.3 Formation of autophagic vesicles induced by Salidroside

圖4 紅景天苷誘導(dǎo)HT29細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡細(xì)胞器的累積Fig.4 Accumulation of acidic vesicle organelles in HT29 cells induced by Salidroside

圖5 紅景天苷對PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響Fig.5 Effect of salidroside on PI3K/AKT/mTOR signal-ing pathwayNote:Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

自噬即細(xì)胞的自我吞噬，是細(xì)胞內(nèi)的重要降解機(jī)制，由膜包囊泡包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)進(jìn)行降解。自噬作為細(xì)胞內(nèi)降解過程，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和保證細(xì)胞生存至關(guān)重要。細(xì)胞凋亡指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動死亡過程，腫瘤細(xì)胞的重要特征之一是由于細(xì)胞凋亡通路受阻而導(dǎo)致的無限增殖。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展需要微環(huán)境的支持與保護(hù)，自噬和細(xì)胞凋亡在結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，PI3K/Akt/mTOR通路能調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬及凋亡信號傳導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，其還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，對控制結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響[6-7]。

中藥紅景天的藥用價值很高，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明其具有活血化瘀、抗心肌缺血的作用，在治療婦女白帶、咳嗽、肺熱、咯血及咳血等方面療效顯著[8]。紅景天苷作為紅景天的主要有效成分之一，藥理學(xué)研究證明其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)、抗衰老、肝臟保護(hù)、神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)及影響物質(zhì)代謝等多種作用[9]。據(jù)報道，紅景天苷能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，如肝癌SMMC-7721細(xì)胞和QGY-7703細(xì)胞等[10]。

MTT檢測發(fā)現(xiàn)，紅景天苷作用24 h后對細(xì)胞無明顯抑制作用(P>0.05)，而經(jīng)紅景天苷(0.5、1.0、2.0 mmol/L)作用48、72 h后與對照組相比均能顯著抑制HT29細(xì)胞活力(P<0.05)，提示紅景天苷能有效抑制人CRC HT29細(xì)胞增殖；赫斯特染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.0、2.0 mmol/L紅景天苷處理48 h后，紅景天苷組凋亡細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增加(P<0.05)，提示紅景天苷具有促進(jìn)人CRC HT29細(xì)胞凋亡作用。

LC3是哺乳動物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，被視為自噬體形成的特殊標(biāo)志，定位于自噬小體膜，參與自噬過程[11]。自噬發(fā)生時，LC3由Ⅰ型轉(zhuǎn)化為Ⅱ型，且LC3表達(dá)上調(diào)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，紅景天苷組HT29細(xì)胞中LC3綠色熒光染色強(qiáng)度較對照組增加，提示紅景天苷治療可促進(jìn)LC3自噬泡的形成；吖啶橙染色發(fā)現(xiàn)，隨著紅景天苷濃度增加，吖啶橙著色的酸性囊泡細(xì)胞器紅色增強(qiáng)，而對照組僅顯弱紅色，提示紅景天苷能促進(jìn)細(xì)胞自噬，與LC3免疫熒光染色結(jié)果基本一致，可能與其抗腫瘤作用相關(guān)。

PI3K/Akt/mTOR通路是一條經(jīng)典的抑自噬、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用[12]。細(xì)胞內(nèi)活化的 PI3K是一種廣泛存在于胞質(zhì)內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，能促進(jìn)PIP2轉(zhuǎn)化為PIP3，激活下游信號分子Akt，進(jìn)而激活其下游的mTOR，磷酸化的mTOR能通過清除泛素蛋白抑制自噬發(fā)生，還能使細(xì)胞周期素上調(diào)而加速細(xì)胞周期[13]；PI3K/Akt/ mTOR還是與細(xì)胞凋亡關(guān)系最密切的信號傳導(dǎo)通路之一，能通過抑制各種癌細(xì)胞的凋亡促進(jìn)細(xì)胞生長[14-15]。Akt是一種抗凋亡信號分子，其在PI3K調(diào)控下激活，經(jīng)多種途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡[16-17]。因此，通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制Akt活性可激活細(xì)胞凋亡。Western blot結(jié)果顯示，不同濃度紅景天苷均可顯著抑制p-P13K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)(P<0.05)。提示紅景天苷可抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化，激活TH29細(xì)胞自噬反應(yīng)，同時提高自噬流導(dǎo)致自噬反應(yīng)過度，進(jìn)一步促進(jìn)HT29細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞損傷，抑制腫瘤。

綜上所述，細(xì)胞自噬和凋亡在CRC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，紅景天苷通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，一方面誘導(dǎo)人CRC細(xì)胞HT29凋亡，另一方面促進(jìn)其發(fā)生自噬性死亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，課題組將進(jìn)一步探究紅景天苷對CRC細(xì)胞的抑制效應(yīng)，以期為臨床治療提供支持。