余 鵬 宋詠剛 黃 卓 閔 海 黃江濤 張世超 陳 晉 胡祖權(quán) 王 赟 曾 柱

(貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550025)

利什曼病是蟲媒介導(dǎo)的由利什曼原蟲感染引起的人畜共患病，主要分為內(nèi)臟利什曼病(又稱黑熱病)、皮膚利什曼病以及皮膚黏膜利什曼病，其中以內(nèi)臟利什曼病最為嚴(yán)重，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)期不規(guī)則發(fā)熱、脾臟腫大、貧血、消瘦、白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少和血清球蛋白增加[1]。目前利什曼病的防治尚無有效措施，化療是唯一的治療方法，臨床一線藥物僅有以葡萄糖酸銻鈉為主的少數(shù)幾種，用藥成本高，且具有較為嚴(yán)重的以細(xì)胞毒性為主的副作用，導(dǎo)致治療效果不理想。多個(gè)疾病流行國(guó)家研究發(fā)現(xiàn)，原蟲耐藥性逐年提高是影響利什曼病治療的潛在不利因素[2]。關(guān)于利什曼病發(fā)病機(jī)制及其治療的研究中，研究人員嘗試采用細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)劑作用于免疫系統(tǒng)，激活Th1細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)免疫系統(tǒng)中各種免疫因子，發(fā)揮治療作用[3]。免疫治療有望成為治療利什曼病的重要方法[4]。

樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是目前已知功能最為強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APCs)，可向幼稚T細(xì)胞呈遞抗原激活免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，是連接天然免疫應(yīng)答與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁[5]。DCs在機(jī)體抗感染、抗腫瘤等免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在寄生蟲感染中的作用逐漸被重視。研究發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲可抑制DCs成熟并改變CCR7表達(dá)，從而干擾其遷移，并抑制DCs抗原提呈，下調(diào)DCs表面分子CD40、CD86、HLA-DR表達(dá)[6-8]。DCs對(duì)利什曼原蟲感染后機(jī)體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用，DCs 的任何生物學(xué)行為信息都可能在臨床上開發(fā)出新的治療方法[9]。FAVILA等[10]研究發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲感染DCs 4 h后，DCs基因表達(dá)譜明顯變化，因此認(rèn)為利什曼原蟲感染DCs 4 h是DCs啟動(dòng)相應(yīng)信號(hào)通路從而改變基因表達(dá)、啟動(dòng)針對(duì)利什曼原蟲抗原提呈反應(yīng)，進(jìn)而影響機(jī)體免疫學(xué)功能的關(guān)鍵時(shí)期，早期DCs對(duì)病原體的識(shí)別捕獲對(duì)其免疫功能發(fā)揮以及后續(xù)啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答具有重要意義。綜上，本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)方法分析利什曼原蟲感染DCs早期相關(guān)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)，篩選關(guān)鍵基因，探索DCs在感染早期的應(yīng)答、相關(guān)信號(hào)通路及其分子機(jī)制，為尋找利什曼原蟲感染后基于DCs的免疫治療方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)來源 通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載GSE42088芯片數(shù)據(jù)，比較分析利什曼原蟲感染DCs后4 h樣本數(shù)據(jù)與未感染組數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1差異基因分析 采用RStudio軟件對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理及歸一化處理。通過limma Package篩選，以顯著差異表達(dá)基因DEGs|log2FC|≥1且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.2蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI)構(gòu)建 采用STRING在線工具構(gòu)建DEGs PPI，Cytoscape的“MCODE”插件對(duì)PPI結(jié)果進(jìn)行K-核解析(K-core decomposition，KO)，以自帶算法篩選出DEGs。

1.2.3GO及KEGG功能富集分析 對(duì)DEGs核心模塊進(jìn)行GO功能富集分析，采用RStudio軟件的Cluster Profiler Package進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和可視化呈現(xiàn)，以P<0.05且基因數(shù)>2為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1差異基因分析 RStudio軟件對(duì)GSE42088芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，利什曼原蟲感染4 h前后DCs共有129個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)(|log2FC|≥1,P<0.05)，見圖1，其中上調(diào)基因49個(gè)，下調(diào)基因80個(gè)。按照|log2FC|大小分別從上調(diào)基因和下調(diào)基因中篩選變化倍數(shù)最大的10個(gè)基因，見表1、2。

2.2PPI及核心模塊分析 PPI結(jié)果見圖2。共分析出核心模塊中17個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因(圖3)，其中RSAD2、IFI44L、IFI44、IFIT3、IFIT2、IFIT5、MX1、IRF7、CMPK2與IFN表達(dá)調(diào)控相關(guān)，且在利什曼原蟲感染后表達(dá)上調(diào)(表3)。

2.3GO分析和KEGG富集分析 GO富集分析結(jié)果顯示有23個(gè)富集結(jié)果(圖4)，多數(shù)涉及病毒感染過程的相關(guān)細(xì)胞反應(yīng)，包括對(duì)病毒的響應(yīng)(GO∶0009615)、對(duì)病毒的防御反應(yīng)等細(xì)胞反應(yīng)(GO∶0051607)以及Ⅰ-IFN相關(guān)免疫反應(yīng)(GO∶0060337、0071357、0034340)。KEGG富集分析結(jié)果顯示存在3個(gè)通路富集(圖5)，分別涉及甲型流感(hsa05164，圖6)、麻疹(hsa05162，圖7)及DNA復(fù)制(hsa03030)。

表1 利什曼原蟲感染早期DCs部分DEGs(上調(diào)基因)

表2 利什曼原蟲感染早期DCs部分DEGs(下調(diào)基因)

表3 核心模塊分析與IFN相關(guān)基因表達(dá)情況

圖1 差異基因分析聚類圖Fig.1 Cluster diagram of differential gene analysisNote:A.Experiment group;B.Control.Red represents up-regulated expression;green represents down-regulated expression.

圖2 差異表達(dá)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI networks of differentially expressed proteins

圖3 核心模塊分析Fig.3 Core module analysis

圖4 DEGs GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs

圖5 DEGs KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of DEGs

圖6 KEGG富集分析-甲型流感Fig.6 KEGG enrichment analysis-Influenza A

圖7 KEGG富集分析-麻疹Fig.7 KEGG enrichment analysis-Measles

3 討論

WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，利什曼病全球每年約有70萬～100萬新發(fā)病例，死亡人數(shù)達(dá)2.6萬～6.5萬，主要集中于非洲東部地區(qū)、南美洲及東地中海地區(qū)[11]。目前利什曼病治療尚無特效藥。利什曼病治療藥物主要?dú)猜x，如銻劑、米替福辛、巴龍霉素、兩性霉素B等，但總體療效并不理想[2，12-15]。隨著研究的深入，免疫治療有望成為攻克利什曼病的重要治療方式。GUPTA等[16]研究發(fā)現(xiàn)，利什曼原蟲感染機(jī)體后，會(huì)出現(xiàn)免疫逃逸行為，主要表現(xiàn)為通過阻止C5-C9膜攻擊復(fù)合物形成阻斷補(bǔ)體系統(tǒng)激活、改變TLR2/TLR4信號(hào)通路抑制細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)、防止巨噬細(xì)胞內(nèi)吞小體與溶酶體的融合、降低B7和CD40表達(dá)從而抑制T細(xì)胞抗寄生蟲效應(yīng)、抑制JAK/STAT通路抑制巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子激活信號(hào)激活以及改變細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)水平等。SCOTT等[3]發(fā)現(xiàn)，機(jī)體Th1/Th2平衡是利什曼病患者治療及預(yù)后的重要指標(biāo)，通過細(xì)胞因子調(diào)節(jié)其平衡于利什曼病治療可能具有積極作用，且DCs在維持利什曼原蟲感染后機(jī)體Th1/Th2平衡中發(fā)揮重要作用[17]。通過改善感染后體內(nèi)相應(yīng)細(xì)胞因子水平、阻斷不利的信號(hào)途徑以及化療與免疫治療聯(lián)用等方式治療利什曼病已取得一定進(jìn)展[18-19]。DCs作為目前已知體內(nèi)功能最為強(qiáng)大的APCs，在抗細(xì)菌、抗病毒、抗寄生蟲感染機(jī)體的早期及抗感染免疫反應(yīng)的整個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。因此，闡明病原體感染過程對(duì)DCs生物學(xué)行為的影響有利于理解其免疫學(xué)過程發(fā)生發(fā)展，為基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)掘出新的更有針對(duì)性的免疫療法提供參考。

本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)方法篩選出利什曼原蟲感染DCs早期的差異基因，以期為準(zhǔn)確理解該免疫學(xué)過程、尋找相關(guān)靶點(diǎn)、尋找利什曼原蟲感染的免疫治療方法提供思路。結(jié)果表明，感染前后共有129個(gè)基因出現(xiàn)差異表達(dá)(|log2FC|≥1,P<0.05)，其中上調(diào)基因49個(gè)，下調(diào)基因80個(gè)，進(jìn)一步篩選出變化最為顯著的10個(gè)上調(diào)基因(IL12B、CXCL10、RSAD2、CSRP2、IFIT2、CMPK2、GALNT3、IFIT3、IFI44L、MX1)和10個(gè)下調(diào)基因(EGR3、NR4A2、EGR1、SNORD3、DEPTOR、MEF2C、LRRC25、DDIAS、CDCA7L、NUDT7)，其中IL12B、CXCL10差異最為顯著。IL12B是編碼IL12的亞單位，IL12主要由受抗原刺激的炎癥細(xì)胞(如DCs)產(chǎn)生，可作用于T細(xì)胞和NK細(xì)胞，具有廣泛的生物學(xué)活性，細(xì)菌、寄生蟲、真菌等病原體均是強(qiáng)有力的刺激因素。IL12誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)Th1類細(xì)胞因子如IFN-γ產(chǎn)生，又可抑制Th2類因子如IL-4、IL-13產(chǎn)生，從而抑制Th2細(xì)胞免疫應(yīng)答，引發(fā)機(jī)體抗寄生蟲感染的免疫反應(yīng)[20]。利什曼原蟲感染可刺激DCs產(chǎn)生IL12，且IL12可使機(jī)體免疫系統(tǒng)啟動(dòng)Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[21-24]。由此猜測(cè)IL12B在利什曼原蟲感染DCs后IL12的產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用，可能是潛在的治療靶點(diǎn)。CXCL10參與多種疾病的免疫調(diào)控過程，如腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等，主要參與T細(xì)胞趨化遷移，當(dāng)DCs受到抗原刺激后分泌CXCL10，從而趨化效應(yīng)T細(xì)胞向炎癥部位遷移，進(jìn)而發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)[25-27]。在寄生蟲感染過程中，CXCL10對(duì)于維持T細(xì)胞免疫學(xué)功能具有重要作用[28]。CXCL10可降低宿主肝臟及脾臟的利什曼原蟲負(fù)載，抑制局部臟器感染加重，對(duì)感染宿主具有部分保護(hù)作用，但具體機(jī)制尚未明確[29-30]。最新研究發(fā)現(xiàn)，包括利什曼原蟲在內(nèi)的多種病原體感染機(jī)體后可抑制CXCL10表達(dá)，引發(fā)免疫逃逸或免疫抑制反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致病原體與宿主免疫系統(tǒng)相互作用削弱以提高病原體存活率[31]。因此認(rèn)為對(duì)抗CXCL10的抑制作用可能是針對(duì)病原體感染新的治療策略，值得進(jìn)一步研究。

通過對(duì)篩選出的上下調(diào)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并篩選核心模塊，共分析出17個(gè)關(guān)鍵基因，其中RSAD2、IFI44L、IFI44、IFIT3、IFIT2、IFIT5、MX1、IRF7、CMPK2與IFN調(diào)控相關(guān)，且表達(dá)均上調(diào)。GO分析結(jié)果顯示DEGs涉及的生物學(xué)過程主要包括對(duì)病毒的防御反應(yīng)(GO∶0051607)、對(duì)病毒的響應(yīng)(GO∶0009615)、Ⅰ-IFN信號(hào)通路(GO∶0060337)、細(xì)胞對(duì)Ⅰ-IFN的反應(yīng)(GO∶0071357)、對(duì)Ⅰ-IFN的反應(yīng)(GO∶0034340)，說明利什曼原蟲感染DCs可引起強(qiáng)烈的免疫學(xué)效應(yīng)，猜測(cè)利什曼原蟲感染可能呈現(xiàn)類似病毒感染的現(xiàn)象，抗病毒療法尤其是Ⅰ-IFN可能對(duì)利什曼原蟲感染有一定治療效果。IFN可分為3類：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，具有抗腫瘤、抗病毒等作用。既往研究認(rèn)為Ⅱ型IFN主要參與抗寄生蟲感染，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Ⅰ-IFN在機(jī)體抗錐蟲、瘧原蟲、弓形蟲、利什曼原蟲等原蟲感染中也發(fā)揮重要作用[32-35]。機(jī)體在利什曼原蟲感染過程中，可激活Ⅰ-IFN信號(hào)通路，且通過刺激DCs促進(jìn)IFN-α和IFN-β表達(dá)[36-37]。利什曼原蟲感染后刺激DCs產(chǎn)生IL-12，該過程受Ⅰ-IFN信號(hào)通路調(diào)控[10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予感染利什曼原蟲的BALB/c小鼠低劑量IFN-β可使小鼠NK細(xì)胞活力得到一定恢復(fù)，并促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖及IL-12產(chǎn)生[38]。綜上，猜測(cè)Ⅰ-IFN及Ⅰ-IFN信號(hào)通路介導(dǎo)的DCs IL12產(chǎn)生在抗利什曼原蟲感染過程中發(fā)揮重要作用。

KEGG分析富集到甲型流感通路(hsa05164)、麻疹感染通路(hsa05162)、DNA復(fù)制信號(hào)通路(hsa03030)，甲型流感通路及麻疹感染通路均與IL12密切相關(guān)，且2條通路均涉及TLR4/NF-κB調(diào)控。Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)是單個(gè)跨膜非催化性蛋白質(zhì)，屬于跨膜模式識(shí)別受體，參與機(jī)體非特異性免疫，是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，可識(shí)別病原體相關(guān)分子等外源性配體，激活機(jī)體免疫應(yīng)答，廣泛存在于髓源性細(xì)胞、DCs、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞細(xì)胞膜與細(xì)胞器膜表面[39]。目前發(fā)現(xiàn)的13個(gè)TLR中，有9個(gè)與寄生蟲感染相關(guān)，分別為TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR9、TLR11和TLR12[40]。TLR信號(hào)通路涉及多種信號(hào)分子，包括MyD88、TRAF6 MAPKs、NF-κB、IRFs等[41]。針對(duì)利什曼原蟲感染，WHITAKER等[42]研究發(fā)現(xiàn)，可通過表面P8蛋白集落復(fù)合體激活免疫細(xì)胞膜表面TLR4，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子和趨化因子。此外，TLR4還可通過識(shí)別利什曼原蟲的脂磷聚糖激活NF-κB，誘導(dǎo)TNF-α和趨化因子表達(dá)[43-44]。利什曼原蟲感染機(jī)體后，刺激DCs產(chǎn)生IL12也受NF-κB調(diào)控[21]。研究發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲的糖基磷脂酰肌醇可激活TLR4，從而誘導(dǎo)IFN-α/β分泌，增強(qiáng)一氧化氮合酶表達(dá)并合成NO殺傷利什曼原蟲[45]。由此猜測(cè)，利什曼原蟲感染DCs可能通過甲型流感、麻疹通路影響TLR4表達(dá)，進(jìn)而影響IL-12表達(dá)，且TLR4變化可能影響Ⅰ-IFN分泌。

本文采用生物信息學(xué)技術(shù)分析利什曼原蟲感染DCs的早期分子機(jī)制，以期為基礎(chǔ)和臨床研究提供新的思路。本研究結(jié)果提示利什曼原蟲感染早期差異表達(dá)最為顯著的基因?yàn)镮L12B與CXCL10，IL12B的差異表達(dá)可影響IL12分泌，而CXCL10有望成為新的治療靶點(diǎn)。GO分析和KEGG分析結(jié)果顯示，IL12分泌受Ⅰ-IFN信號(hào)通路和TLR4/NF-κB信號(hào)通路影響，2條通路協(xié)同作用，由此猜測(cè)Ⅰ-IFN/IL12信號(hào)通路與TLR4/NF-κB/IL12信號(hào)通路可能成為利什曼原蟲感染治療的靶點(diǎn)。另一方面利什曼原蟲感染DCs后，根據(jù)富集分析結(jié)果猜測(cè)可能會(huì)出現(xiàn)類似病毒感染的現(xiàn)象，結(jié)合既往研究推測(cè)抗病毒免疫療法可能對(duì)利什曼原蟲感染具有一定療效。