韋宜慧 陳嘉琪 趙光宇 董玉紅 厚凌宇 焦如珍

(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點實驗室國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室 北京 100091)

磷在植物能量傳遞和儲存、光合作用、細胞分裂及物質運轉等生理過程中發(fā)揮重要作用。磷具有促進根的發(fā)育、植物的快速生長、提高水分利用效率和抗逆性的能力(周德貴等， 2018； Bononietal.， 2020)。如果植物缺磷，會造成生長緩慢，且根系生長會受到抑制。研究發(fā)現(xiàn)，土壤中存在大量具有溶磷能力的細菌，這些細菌能將土壤中的難溶性磷酸鹽轉化為植物可吸收利用的水溶性磷，從而提高土壤磷可利用率，促進植物的生長(張藝燦等， 2020)。由于溶磷微生物具有節(jié)能、環(huán)保、來源廣泛等特點，已經(jīng)成為當前研究熱點(陳玲等， 2018； Chawngthuetal.， 2020)。溶磷菌在農(nóng)作物上的應用研究已有許多報道，如水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)等，但關于林木方面的研究較少。

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方用材林主要造林樹種，造林面積列居全國首位，在我國林業(yè)生產(chǎn)中占有極其重要地位，但長期集約化生產(chǎn)造成杉木林生產(chǎn)力下降，人們通過施用化肥來提高產(chǎn)量(盛煒彤等， 2003； 于寧樓等， 2003)，但肥效時間短，利用率低。南方地區(qū)淋溶強烈，土壤富含鋁離子和鐵離子，磷極易被固定，土壤磷利用率極低，磷肥的投入量是植物實際吸收能力的2倍，導致磷養(yǎng)分供給不足，嚴重制約了杉木人工林可持續(xù)發(fā)展(李杰等， 2011； Pantigoso， 2019)，因此有效磷缺乏是限制杉木生產(chǎn)力的主要因素之一(于姣妲等， 2018)。溶磷菌作為新型生物肥料，具有巨大的促生潛力，既可以提高植物對磷的吸收，減少對化肥的依賴，又可以提高土壤肥力，優(yōu)化磷資源的使用，與化肥相比更環(huán)保(Kudoyarovaetal.， 2017； Kuntyastutietal.， 2017； 劉春菊等， 2020)。因此，篩選高效溶磷菌對提高土壤磷利用率，促進杉木生長具有重要意義。

篩選高效溶磷菌是溶磷菌廣泛應用于實踐生產(chǎn)的基礎和前提。為獲得適應性強且穩(wěn)定的菌株，需要對溶磷菌進行培養(yǎng)條件優(yōu)化，而培養(yǎng)環(huán)境因子和培養(yǎng)基成分是不得不考慮的問題。影響溶磷菌溶解磷酸鹽的因素繁多，如何篩選出適應力強的高效溶磷菌顯得尤為重要。了解溶磷菌的溶磷特性可為制備高效溶磷菌打下良好的基礎，有利于將其更好地應用于生產(chǎn)實踐。本研究以杉木林地土壤及杉木植物為材料，擬分離篩選出具有高效溶磷能力的菌株，并篩選出最佳溶磷條件，探究其生態(tài)適應性和溶磷特性，以期獲得更高效穩(wěn)定的溶磷菌株，為微生物肥料研制提供理論依據(jù)，減少化肥使用，緩解杉木人工林地力衰退，提高杉木人工林生產(chǎn)力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤樣品采自江西省分宜縣大崗山山下林場(27°36′N， 114°24′E)，地貌屬低山丘陵，海拔220～300 m。年均氣溫17.2 ℃，年均降水量1 600 mm，屬亞熱帶季風氣候，土壤類型為紅壤。杉木人工林林齡為18年生，林分密度3 067株·hm-2，林下植物優(yōu)勢種為狗脊(Cibotiumbarometz)、大青(Clerodendrumcyrtophyllum)、三花懸鉤子(Rubustrianthus)、杜莖山(Maesajaponica)。在杉木人工林內布設樣方(20 m×30 m)，在樣方內取土， 2018年9月采樣，采樣深度0～20 cm。通過S形采樣法在樣地內布設7個采樣點，除去枯枝落葉層后用土鉆鉆取0～20 cm土壤，將7個采樣點土壤混合置于無菌袋中，冰袋保存帶回實驗室。分離篩選杉木內生菌所用植物樣品為中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)實驗中心提供的長勢良好的2年生杉木實生苗。

PVK固體培養(yǎng)基： 葡萄糖10 g，Ca3(PO4) 25 g，CaCO35 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，KCl 0.1 g，MnSO40.002 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH7.0。

PVK液體培養(yǎng)基： 即PVK固體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.2 溶磷菌初篩

稱取土樣10 g于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，28 ℃搖床振蕩30 min。將土壤懸浮液連續(xù)稀釋10-2、10-3、10-4，取0.1 mL稀釋度為10-3、10-4土壤懸浮液涂布于PVK瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7天。觀察平板是否長出產(chǎn)生溶磷圈的菌落。挑取溶磷圈較大的菌落，用連續(xù)劃線法進一步分離純化。

將整株杉木根、莖、葉分離，置于流水下沖洗24 h，除去表面泥土及雜質，濾紙吸干水分后，用剪刀截成2 cm長的小段，分別稱取根、莖、葉各1 g置于已滅菌的培養(yǎng)皿中。在超凈臺上進行表面消毒： 在體積分數(shù)75%酒精中浸泡30 s后置于6%次氯酸鈉溶液浸泡5 min，無菌水沖洗7次，將已消毒的植物組織材料放置在無菌研缽中，加入少量無菌水研磨成勻漿，取0.1 mL涂布于PVK平板上，最后一次清洗的無菌水作為對照，設3個重復，28 ℃培養(yǎng)5～7天，觀察平板是否存在產(chǎn)生溶磷圈的菌落。挑取溶磷圈明顯的菌落進行純化并觀察記錄菌落特征。

1.3 溶磷菌復篩

將菌株接種到PVK液體培養(yǎng)基中，28 ℃往復搖床180 r·min-1培養(yǎng)7天，然后測定培養(yǎng)基pH值。培養(yǎng)液8 000 r·min-1離心15 min，以去除細菌菌體。取上清液用分光光度計，在420 nm波長下，用鉬銻鈧比色法(張祥勝， 2008)測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量。

1.4 溶磷菌生理生化試驗

溶磷菌常規(guī)生理生化鑒定按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法進行，主要包括革蘭氏染色、葡萄糖水解試驗、乳糖水解試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、產(chǎn)硫化氫試驗、明膠液化試驗、檸檬酸鹽利用試驗、丙二酸鹽利用試驗、反硝化作用試驗。

1.5 16S rDNA基因序列測定

用北京博邁德生物科技有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，以DNA為模板，用細菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進行PCR擴增，擴增體系如下： DNA模板1 mL，引物27F 0.5 mL，1492R 0.5 mL，2×TaqMix 12.5 mL，ddH2O 10.5 mL。PCR程序如下： 93 ℃ 3 min，93 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，32個循環(huán)； 72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物由華大基因進行雙向測序。將測得的16S rDNA序列用ContigExpress軟件拼接好后，分別在GenBank、EzTaxon、BIGSdb數(shù)據(jù)庫中搜索，選取同源性較高的模式菌株，通過MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，置信度通過重抽樣法(Bootstrap=1 000)計算獲得。

1.6 溶磷特性研究

采用單因素試驗，測定不同pH、溫度、碳源、氮源及磷源培養(yǎng)條件下溶磷菌的溶磷能力。以PVK液體培養(yǎng)基為基礎，pH分別設置為4、5、6、7、8、9、10； 培養(yǎng)溫度設置為10、15、20、25、30、35、40 ℃。分別以0.5、5.0、10.0 g·L-1的濃度提供不同碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉)、氮源(硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母浸粉)、磷源(磷酸鈣、磷酸鐵、磷酸鋁)。按體積分數(shù)2%接種量將OD600=0.5的菌液接種于PVK培養(yǎng)液中(3個重復)。28 ℃搖床培養(yǎng)7天，以未接種PVK液體培養(yǎng)基為對照，用鉬銻鈧比色法測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

運用Excel軟件進行數(shù)據(jù)記錄，SPSS24.0軟件對溶磷能力進行方差分析(ANOVA)，在MEGA7.0中采用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結果與分析

2.1 溶磷菌菌落特征

從杉木林地土壤及杉木苗木植株共分離純化得到20株溶磷菌，有13株溶磷菌分離自杉木林地土壤，5株來自杉木植株根系，1株分離自杉木植株莖部，另1株來自葉片(表1)。細菌菌落形態(tài)特征指標一般包括形狀、顏色、表面狀態(tài)、光澤等。對所分離的20株溶磷菌的形態(tài)特征進行了觀察記錄(圖1)。大部分菌株菌落成白色或淡黃色、圓形、表面濕潤，少數(shù)菌落透明。

表1 溶磷菌在PVK培養(yǎng)基上的菌落特征①Tab.1 Colony characteristics of phosphate solubilizing bacteria on PVK medium

圖1 分離菌株特征Fig.1 Characteristics of isolated strains

2.2 溶磷菌溶磷能力

將菌株接種于以磷酸鈣為唯一磷源的PVK液體培養(yǎng)基中，測定培養(yǎng)液中可溶性磷含量，發(fā)現(xiàn)各菌株溶磷能力存在顯著差異(表2)。從表2可以看出， 20株菌株的可溶性磷含量在21.21～195.61 mg·L-1之間，其中菌株P5具有最強的溶解磷酸鈣的能力，且顯著高于其他菌株； 其次是RP2、RP22和RP23。

表2 分離菌株溶磷能力Tab.2 Determination of phosphate solubilizing ability (mg·L-1)

2.3 溶磷菌生理生化特征

對篩選出的溶磷菌進行生理生化鑒定，除P7外，篩選菌株均為革蘭氏陰性菌，葡萄糖水解試驗均為陽性，乳糖水解僅RP23、RP24為陰性，硫化氫試驗僅RP23為陽性，檸檬酸鹽試驗為陰性的是P2、RP23，其他菌株均為陽性。丙二酸鹽試驗僅有RP22為陽性。其中LP2、RP2和RP22生理生化特征相似，均可利用葡萄糖、乳糖，甲基紅試驗陰性，V-P試驗陽性(表3)。

2.4 16S rDNA基因序列比對分析

對20株菌株的16S rDNA基因進行擴增，獲得了約1 350 bp的16S rDNA基因的核苷酸序列。在GenBank、EzTaxon、BIGSdb數(shù)據(jù)庫進行BLAST(表4)。16S rDNA序列比對結果顯示， 20株促生菌分別屬于8個屬，其中P7與Bacillusaryabhattai(B8W22)、RP22與Pseudomonasgrimontii(CFML97-514)相似性為100%，而P2的比對結果相似性相對較小(96.52%)。溶磷菌溶磷能力最強的菌株P5為伯克氏菌屬(Burkholderia)，其次是RP2、RP22，二者均為假單胞菌屬(Pseudomonas)。用ClustalW對20株溶磷菌及其相似菌株進行多序列比對，并利用MEGA7.0軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)構建溶磷菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)確定了各菌株的種類。圖中發(fā)育樹僅顯示自展值大于70的數(shù)值。

表3 溶磷菌生理生化特征①Tab.3 Physiological and biochemical features of phosphate solubilizing bacteria

表4 基于16S rDNA序列鑒定結果Tab.4 Identification based on 16S rDNA sequence

圖2 基于16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic evolutionary tree based on 16S rDNA sequences

2.5 影響溶磷菌溶磷特性的環(huán)境條件

2.5.1 pH對溶磷菌溶磷能力的影響 由圖3可知，pH在4～7時，RP2和RP22溶磷能力隨著pH的升高而增加，而P5則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。pH在8～10時，各菌株的溶磷能力隨著pH的升高而降低。P5菌株在各pH條件下其溶磷能力均高于RP2和RP22，具有較廣的pH適應范圍，在pH為5時，培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高，pH為4時仍具有較高的溶磷能力，說明P5耐酸。RP2和RP22在pH為7時溶磷能力達到最高。總的來看，pH為5～7時，各菌株均表現(xiàn)出最高的溶磷能力。

2.5.2 溫度對溶磷菌溶磷能力的影響 不同溫度對溶磷菌溶磷能力的影響如圖4所示，在25～35 ℃時3株菌株均表現(xiàn)出較高的溶磷能力，P5和RP2的最適溫度為30 ℃，RP22的最適溫度為25 ℃。此外，P5對溫度的適應性較強，在各溫度條件下溶磷能力均顯著高于RP2和RP22，且在40 ℃高溫條件下仍具有較高的溶磷能力。在30～40 ℃，各菌株隨著溫度的升高，溶磷能力逐漸降低。

圖3 pH對溶磷菌溶磷能力的影響Fig.3 Effect of pH on the ability of phosphate solubilizing bacteria同一小寫字母表示同一菌株的差異不顯著，P=0.05。下同。The same lowercase letter means that the same strain is not significantly different at P=0.05，the same below.

圖4 溫度對溶磷菌溶磷能力的影響Fig.4 Effect of temperature on the ability of phosphate solubilizing bacteria

2.5.3 碳源對溶磷菌溶磷能力的影響 不同碳源對溶磷菌的溶磷能力有顯著影響(圖5)。P5以蔗糖為碳源時溶磷能力最高，為203.43 mg·L-1，葡萄糖次之，以乳糖和甘露醇為碳源時溶磷能力最低。RP2在以葡萄糖為碳源時溶磷能力最高，其次是蔗糖和麥芽糖，碳源為乳糖和甘露醇時溶磷能力最低。RP22的最佳碳源是葡萄糖，其次是蔗糖和麥芽糖。總體來看，不同碳源條件下P5的溶磷能力優(yōu)于RP2和RP22。

2.5.4 氮源對溶磷菌溶磷能力的影響 由圖6可知，6種不同氮源對菌株溶磷能力的影響差異顯著。P5以氯化銨為氮源時溶磷能力最高，為208.83 mg·L-1，硫酸銨和尿素次之，以蛋白胨為氮源時溶磷能力最低。RP2在以硝酸鉀為氮源時溶磷能力最高，其次是硫酸銨和氯化銨，氮源為酵母浸粉和蛋白胨時溶磷能力最低。RP22的最佳氮源為硝酸鉀，硫酸銨和氯化銨次之。從不同菌株來看，在以硫酸銨、氯化銨、尿素以及蛋白胨為唯一氮源時，菌株溶磷能力的大小排序為P5>RP2>RP22?？傮w來看，不同碳源條件下P5的溶磷能力優(yōu)于RP2和RP22。

圖5 不同碳源對溶磷菌溶磷能力的影響Fig.5 Phosphate solubilizing ability of phosphate solubilizing bacteria at different carbon source

2.5.5 磷源對溶磷菌溶磷能力的影響 3種不同磷源條件下，P5、RP2和RP2溶磷能力如圖7所示。P5菌株在不同磷源中溶磷能力優(yōu)于RP2和RP22，其中以磷酸鈣為磷源時可溶性磷含量最高，其次是磷酸鋁。RP2和RP22對磷酸鈣的溶解能力顯著高于磷酸鐵和磷酸鋁?？偟膩砜?，3株菌對不同磷源的溶解能力大小排序為： 磷酸鈣>磷酸鋁>磷酸鐵。

圖7 不同磷源對溶磷菌溶磷能力的影響Fig.7 Phosphate solubilizing ability of phosphate solubilizing bacteria at different phosphate source

3 討論

3.1 溶磷菌的篩選與鑒定

溶磷菌作為一種對環(huán)境友好的微生物肥料重要成分，可以通過溶解土壤中的難溶性磷酸鹽，提高磷素可利用率，從而有利于促進植物的生長。杉木是我國南方主要用材樹種，然而目前面臨著生產(chǎn)力下降、土壤退化等問題，缺磷是杉木生長的主要限制因子。因此，從杉木林中篩選溶磷菌可以為杉木提供一種新的微生物肥料來源，對杉木生長具有重大意義。

通常采用生理生化鑒定和16S rDNA序列來鑒定細菌菌種。研究表明16S rDNA序列可為細菌鑒定提供有效的種的特異性特征序列，因此，16S rDNA序列測序鑒定細菌已經(jīng)廣泛應用。本文結合生理生化試驗、16S rDNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹，將菌株鑒定至屬。目前已知的溶磷菌主要包括伯克氏菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬，其中假單胞菌屬、伯克氏菌屬和芽孢桿菌屬的研究報道較多。本研究篩選出的高效溶磷菌為伯克氏菌屬和假單胞菌屬。序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育樹表明有3株菌株與模式菌株的基因系列具有顯著相似性(>97%)且自展值均大于90。通常相似性大于97%，發(fā)育樹自展值大于70可認為該分類結果是可信的(Rajuetal.， 2018)。

3.2 溶磷菌的溶磷特性

溶磷菌的溶磷能力隨環(huán)境條件的變化而發(fā)生改變。本研究結果顯示篩選出的3株溶磷菌生長最適pH范圍為5～7，最適溫度范圍為25～35 ℃，與Batool等(2019)、楊艷紅等(2015)研究結果一致，并且P5菌株在pH為4、溫度為40 ℃時也具有較強的溶磷能力，說明該菌耐高溫耐酸，能在惡劣環(huán)境條件下生存。P5菌株在以蔗糖為碳源時具有最高的溶磷能力，RP2和RP22則在葡萄糖為碳源時其溶磷能力最強，表明溶磷菌對碳源的利用以單糖和雙糖為主，對多糖的利用率較低，這與喬志偉等(2013)研究結果相同。這可能與糖類的結構有關，單糖是碳水化合物中最基本的單位，微生物可以直接吸收，而多糖則需要分解為單糖后才能被微生物利用。本研究結果表明，P5菌株在以氯化銨為氮源時具有最高的溶磷能力，RP2和RP22則以硝酸鉀為氮源時其溶磷能力最強，以硫酸銨次之，表明溶磷菌對氮源的利用以銨態(tài)氮和硝態(tài)氮為主，這與Park等(2010)研究結果一致。研究發(fā)現(xiàn)，不同氮源會引起溶磷菌分泌的有機酸的種類和數(shù)量發(fā)生變化，從而改變其溶磷能力(Bhabatarinietal.， 2016)。與硝態(tài)氮相比，以銨態(tài)氮為唯一氮源時，溶磷菌分泌的有機酸數(shù)量顯著增加(秦利均等， 2019)。許多研究報道溶磷菌對不同難溶磷酸鹽的溶解能力按強弱排序依次為磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵，本研究也得出一致的結果。Ca-P較易溶解可能與溶磷微生物分泌的有機酸種類有關，也可能是微生物分泌質子和有機酸螯合陽離子雙重作用的結果，而Al-P只能通過螯合作用來釋放磷酸鹽(Pandaetal.， 2016)。此外，一些溶磷菌還可以通過產(chǎn)生H2S將Fe-P轉化為FeSO4，從而溶解磷酸鐵，增加可溶性磷含量(Chakdaretal.， 2018)

4 結論

從杉木林土壤及杉木苗木的根、莖、葉分離獲得3株高效溶磷菌P5、RP2和RP22； 結合生理生化試驗、16S rDNA序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹，將菌株P5鑒定為Burkholderiaubonensis，RP2為Pseudomonasfrederiksbergensis，RP22為Pseudomonasgrimontii。對P5、RP2和RP22的溶磷培養(yǎng)條件進行單因素試驗，各菌株在25～30 ℃，pH5～7時具有最強的溶磷能力，其中P5在pH4、溫度40 ℃時仍具有較高的溶磷能力； 在碳源和氮源試驗中，P5菌株溶磷條件的最佳碳源和氮源分別為蔗糖和氯化銨， RP2和RP22溶磷的最佳碳源和氮源分別為葡萄糖和硝酸鉀； 磷源種類對溶磷菌溶磷能力有顯著影響，3株溶磷菌對磷酸鈣溶解度均大于磷酸鋁和磷酸鐵。