周 瑤，曹欣雨，周佳敏，朱紅艷*

(南通大學(xué)藥學(xué)院藥劑系，南通 226001)

維生素C 在結(jié)構(gòu)上與葡萄糖類似且為多羥基化合物，呈無色無臭的片狀晶體，易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑。其分子中第2 和第3 位上兩個相鄰的烯醇型羥基易解離釋放出H+，因此它具有酸的性質(zhì)，又被稱之為抗壞血酸。在人體中，維生素C 參與許多重要的生物合成過程，具有維持免疫，參與血清素合成，維持血管的完整性，促進(jìn)非血紅素鐵的吸收等功能[1]。同時，維生素C 是一種高效的抗氧化劑，用于降低抗壞血酸過氧化物酶底物的氧化應(yīng)激。因此，很多人會選擇口服維生素C 來達(dá)到美白、維持自身健康等目的[2]。

但是，維生素C 還具有很強(qiáng)的還原性，由于其自身結(jié)構(gòu)，維生素C 很容易被氧化成脫氫維生素C，維生素C 和脫氫維生素C 具有相同的生理功能，而且該反應(yīng)是可逆的，但如果脫氫維生素C 繼續(xù)氧化，則反應(yīng)變成不可逆，進(jìn)而導(dǎo)致其氧化失活，完全喪失其生理效應(yīng)[3]。因此，增加維生素C 的穩(wěn)定性是維持其長期功效的首要問題。脂質(zhì)體是具有類似生物膜結(jié)構(gòu)的磷脂雙層組成的小囊泡，它可以將藥物包裹在亞微米或納米直徑的脂質(zhì)顆粒中，形成的微粒具有類似的生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，且可在體內(nèi)生物降解而不具有免疫原性。故選擇脂質(zhì)體作為包埋體系，可對維生素C 起到保護(hù)與緩控釋作用[4-5]。此外，脂質(zhì)體維生素C 還具備改善體內(nèi)吸收的優(yōu)點(diǎn)。腸道細(xì)胞攝入較高劑量的維生素C 會導(dǎo)致產(chǎn)生過量的氣體和(或)腹瀉，而脂質(zhì)體維生素C 的生物利用度明顯高于常規(guī)維生素C，幾乎是普通維生素C 的兩倍[6-7]。因此，本研究擬制備一種口服維生素C 脂質(zhì)體，探討其理化性質(zhì)和穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 大豆磷脂(純度99%)(大連華農(nóng)豆業(yè)科技發(fā)展有限公司)；膽固醇、維生素C(純度99.98%)、NaOH(分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)；UV-1800 紫外可見分光光度計(上海菁華科技有限公司)；KQ-50DA 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；馬爾文納米粒度電位儀ZetasizerNano ZS90(英國馬爾文儀器有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計 以藥脂比(A：維生素C 與大豆磷脂質(zhì)量比)、超聲時間(B)、載藥溫度(C)作為考察因素，選取恰當(dāng)?shù)乃剑肔9(33)正交試驗(yàn)法來優(yōu)化處方[8]，正交試驗(yàn)設(shè)計如表1 所示。

表1 正交試驗(yàn)水平及因素

1.2.2 維生素C 脂質(zhì)體的制備 采用非溶劑法，在相對較低的溫度下制備脂質(zhì)體。取400 mg 大豆磷脂，溶于5 mL 純化水中得到溶于水相中的脂質(zhì)體材料，再加入1 000 mg 維生素C 進(jìn)行乳化，水浴加熱攪拌一段時間后加入217 mg NaOH，pH 值約為5.16(維生素C 在酸性環(huán)境中較為穩(wěn)定)，并保持水浴條件繼續(xù)攪拌，最后將該脂質(zhì)體超聲一段時間后即得到最終產(chǎn)品維生素C 脂質(zhì)體[9]。

1.2.3 維生素C 脂質(zhì)體的粒徑、聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)及電位測試 分析正交試驗(yàn)結(jié)果得出最優(yōu)配方，將該配方重復(fù)制備3 次，采用馬爾文納米粒度電位儀測量其粒徑大小、PDI及Zeta 電位，以驗(yàn)證該配方是否為維生素C 脂質(zhì)體的最優(yōu)處方。

1.2.4 維生素C 脂質(zhì)體的電鏡測試 分別取1 mg/mL維生素C 脂質(zhì)體溶液20 μL，滴加至銅網(wǎng)上維持5 min，濾紙吸去多余溶液，滴加20 μL 的2%磷鎢酸溶液復(fù)染，維持5 min，濾紙吸去多余溶液，將銅網(wǎng)在紅外燈下干燥2 min，透射電子顯微鏡對樣品進(jìn)行觀察并拍照。

1.2.5 維生素C 脂質(zhì)體的包封率測試

1.2.5.1 維生素C 含量的測定 采用紫外分光光度法測定維生素C 的含量。取1.25 mg 維生素C 溶于25 mL 容量瓶中，定容。精密量取8、4、3、2、1 mL 于10 mL 容量瓶中，定容并搖勻，紫外分光光度法在257 nm 處測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線即可用于維生素C 含量的測定。

1.2.5.2 包封率的測定 維生素C 脂質(zhì)體5 mL 置于纖維素透析袋(MwCO 1000)，于200 mL 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)中透析12 h。將游離維生素C 與脂質(zhì)體進(jìn)行分離后，采用紫外分光光度法測定PBS 透析液中游離維生素C 的含量，根據(jù)下式計算包封率[8]。

W游是游離維生素C 的含量；W總是總投維生素C 的含量。

1.2.6 維生素C 脂質(zhì)體的釋藥行為檢測 以PBS為釋放介質(zhì)，采用透析法來模擬體外釋放實(shí)驗(yàn)。分別制備5 mL 體積中各含有1 000 mg 維生素C 的水溶液和維生素脂質(zhì)體，然后將上述兩種不同的溶液，置于準(zhǔn)備好的透析袋中，置于含有1 000 mL PBS 的燒杯中，30 ℃恒溫水浴攪拌，分別于2、4、6、8、10、12、24 h 取釋放介質(zhì)100 μL，用紫外分光光度法測定其吸光度，計算其釋藥量，并及時補(bǔ)充相同體積的純化水。釋藥的計算公式如下：

Cn為第n 個點(diǎn)測得的藥物濃度，Ci為第i 個取樣點(diǎn)得到的藥物濃度，Vn為釋放介質(zhì)的總體積，Vi為取樣體積，W 為總投藥含量。

1.2.7 維生素C 脂質(zhì)體的穩(wěn)定性 除包封率外，穩(wěn)定性也是評價維生素C 脂質(zhì)體的重要指標(biāo)，脂質(zhì)體能否穩(wěn)定的儲存，很大程度上決定了維生素C 脂質(zhì)體的使用期限。

將制備得到的維生素C 脂質(zhì)體分別置于4 ℃和室溫25 ℃，觀察30 d 內(nèi)脂質(zhì)體的顏色和形態(tài)變化。并在不同時間同時取4 ℃和25 ℃下儲存的同一批制備的脂質(zhì)體，稀釋30 倍，使用純化水作為空白對照組，測定脂質(zhì)體在500 nm 處的吸光度，用于反映脂質(zhì)體粒徑大小的變化。吸光度的增大表明脂質(zhì)體分子的熱運(yùn)動加劇，其內(nèi)部發(fā)生了聚集，從而使粒徑變大，意味著脂質(zhì)體不穩(wěn)定的發(fā)生[10]。

2 結(jié) 果

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果對各組的包封率進(jìn)行均值和極差分析，可得各因素對包封率的影響因素A＞C＞B。分析均值得出最佳配方應(yīng)為A1B1C1，即在藥脂比為1 000∶400，載藥溫度為30 ℃，超聲時間為10 min 的條件下制備得到的維生素C脂質(zhì)體有較好的平均粒徑、多聚分散度、Zeta 電位、及維生素C 包封率，見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2 最佳配方的質(zhì)量評價 新制備的A1B1C1維生素C 脂質(zhì)體，其平均粒徑為(180.80±3.91) nm，PDI 為0.18±0.20，Zeta 電位為(-52.88±1.83) mV，平均粒徑＜200 nm，Zata 電位位于-30～-60 mV 的脂質(zhì)體溶液是很穩(wěn)定的。故該方法及配方可用于制備穩(wěn)定的維生素C 脂質(zhì)體。由維生素C 脂質(zhì)體的透射電鏡圖(圖1A)可知，該脂質(zhì)體的形態(tài)為類圓形，分布均勻，輪廓光滑，可見其顆粒為囊狀，脂質(zhì)體中包含了較多水溶性物質(zhì)。測定不同濃度下維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1B。根據(jù)公式計算優(yōu)選配方維生素C 脂質(zhì)體包封率為(39.68±1.36)%。從圖1C 可見，維生素C 溶液在2 h 時即釋放≥60%的維生素C 含量，而維生素C 脂質(zhì)體釋放的維生素僅為其一半。而在24 h 后，維生素C 溶液的含量釋放＞80%，而脂質(zhì)體僅為60%多。因此，維生素C 脂質(zhì)體可延長維生素C 的作用時間，提高維生素C 的利用度。此外，將所制備的脂質(zhì)體置于4 ℃儲存30 d 后，顏色仍為乳白色，未發(fā)生分層與沉淀現(xiàn)象；置于25 ℃儲存30 d 后，也未發(fā)生沉淀或分層，但顏色變?yōu)辄S褐色，可能部分維生素C 發(fā)生了氧化。由圖1D 可知維生素C 脂質(zhì)體在500 nm 處的吸光度隨著儲存時間的增加而逐漸增大，表明維生素C 脂質(zhì)體的粒徑隨著時間的延長而增大。且25 ℃條件下維生素C 脂質(zhì)體吸光度較4 ℃條件下更易增加，故該維生素C 脂質(zhì)體宜保存在相對較低的溫度。

3 討 論

隨著人們生活水平的提高，維生素C 可被用于日常生活中提高免疫力、美白抗氧化及抗衰老而為越來越多的人所接受，雖然維生素C 作為一種微量元素可從日常食用的瓜果蔬菜中獲得，但由于其易溶于水，極易隨身體中水分流失，同時由于其自身結(jié)構(gòu)的特殊性，易氧化失去作用[11]。而脂質(zhì)體制劑可有效避免維生素C 這些缺點(diǎn)，且其本身具有諸多優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的關(guān)注。

目前制備脂質(zhì)體主要有物理分散法、兩相分散法及表面活性劑增溶法等[12]，但這些方法大都涉及有機(jī)溶劑，不適合制備口服制劑。本研究在藥脂比為1 000∶400，載藥溫度為30 ℃，超聲時間為10 min 的條件下，采用非溶劑的方法制備維生素C 脂質(zhì)體。獲得的維生素C 脂質(zhì)體具有分散度好，形態(tài)穩(wěn)定等特性，并能增加維生素C 脂溶性，提高其吸收、避免氧化、發(fā)揮緩釋作用等，可作為口服補(bǔ)充維生素C的良好劑型，同時該脂質(zhì)體宜避光、低溫保存，增加其保質(zhì)時間[13]。故本文采用非有機(jī)溶劑的方法制備得到的口服脂質(zhì)體維生素C，擬用以替代維生素C靜脈注射及常用的維生素C 口服片劑。

但本法制備的維生素C 脂質(zhì)體包封率不高，可能與非有機(jī)溶劑制備方法有關(guān)，此種采用被動載藥方式制得的脂質(zhì)體，包封率普遍較低；同時，為了減少人體對膽固醇的攝取，本配方中未加膽固醇，由此影響了維生素C 脂質(zhì)體的包封率，故考慮進(jìn)一步優(yōu)化處方或選用植物甾醇代替膽固醇，調(diào)節(jié)脂質(zhì)雙分子層的流動性以增加包封率，同時降低膽固醇引起的心血管疾病的風(fēng)險[14-15]。