郝紫微,吳瀟,戴雨沁,王鵬,張紹鈴

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院梨工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210095)

近些年,梨早期落葉問(wèn)題較為嚴(yán)重,一直影響梨的產(chǎn)量和品質(zhì),使果農(nóng)每年都遭受很大損失。梨早期落葉是指在10月中上旬以前,梨正常生長(zhǎng)期內(nèi)出現(xiàn)的葉片大量脫落現(xiàn)象[1]。梨早期落葉的誘因有:氣候異常、病蟲危害、管理不當(dāng)和品種適應(yīng)性不良等[2-3]。早期落葉會(huì)嚴(yán)重影響樹體營(yíng)養(yǎng)累積,造成第2年梨果產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4]。在我國(guó)各產(chǎn)梨區(qū)均有不同程度的早期落葉現(xiàn)象發(fā)生,尤其是長(zhǎng)江以南砂梨產(chǎn)區(qū)發(fā)生范圍較廣,危害較重[5]。梨花芽為混合芽,屬夏秋分化型,通?；ㄑ吭?月已完成分化,且具備開(kāi)花能力。梨早期大量落葉后,若遇到水分、溫度適宜,樹體則會(huì)打破休眠,部分花芽和葉芽萌發(fā),出現(xiàn)二次開(kāi)花和抽梢現(xiàn)象,導(dǎo)致樹勢(shì)減弱,嚴(yán)重影響梨的產(chǎn)量和品質(zhì)。

植物器官脫落受多種激素的協(xié)同調(diào)控[6],對(duì)乙烯、赤霉素(GA)、生長(zhǎng)素、脫落酸(ABA)、細(xì)胞分裂素這5種激素研究較多[7]。GA是一類化合物的總稱,目前已鑒定出100多種[8],其中GA12是赤霉素合成過(guò)程中重要的中間體,而GA1、GA3、GA4等則具有較強(qiáng)生物活性[9]。目前,赤霉素在果樹上應(yīng)用廣泛,可誘導(dǎo)葡萄產(chǎn)生無(wú)核果實(shí)[10];打破桃芽休眠[11];芒果正常果實(shí)及花梗即將脫落的果實(shí)和花梗的赤霉素含量高[12];噴施外源赤霉素可以抑制葡萄落粒[13];柑橘植株中赤霉素增加可以減少子房和果樹脫落的發(fā)生[14-15]等。另外,赤霉素可以減緩RNA和蛋白質(zhì)失活,增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成能力[16];作為自由基清除劑,GA可提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性,調(diào)控植株衰老過(guò)程[17-18]。

活性氧(ROS)主要包括過(guò)氧化氫(H2O2)和超氧陰離子等,是植物細(xì)胞程序性死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子,與發(fā)育過(guò)程和環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[19],在葉片脫落過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用[20]。研究表明,活性氧的增加會(huì)促進(jìn)植物器官的脫落,如在楊樹[21]、煙草[22]以及荔枝[23]等植物中H2O2可加速植物器官的脫落?？寡趸溉鏢OD可發(fā)生岐化作用產(chǎn)生過(guò)氧化氫和氧氣,再經(jīng)POD和CAT清除H2O2,從而延緩脫落[24]。硝基苯酚可通過(guò)增強(qiáng)SOD、CAT等抗氧化酶活性延緩番茄花和果實(shí)的脫落[25]。

本研究以‘豐水’梨為材料,通過(guò)石蠟切片觀察葉柄離區(qū)組織形態(tài),測(cè)定葉柄離區(qū)赤霉素、活性氧含量及抗氧化酶活性,研究噴施赤霉素后落葉率及活性氧和抗氧化酶的變化,旨在探尋赤霉素延緩‘豐水’梨葉片脫落的生理機(jī)制,為防治砂梨早期落葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

供試品種為砂梨的代表品種‘豐水’梨。試驗(yàn)于2017年9月在四川省成都市龍泉驛區(qū)黃土鎮(zhèn)和天府新區(qū)籍田鎮(zhèn)的‘豐水’梨園進(jìn)行,梨樹樹齡10年,長(zhǎng)勢(shì)良好。試驗(yàn)區(qū)屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū),氣候溫和,四季分明,雨量充沛,日照較少。分別在正常生長(zhǎng)區(qū)(對(duì)照組)與早期落葉嚴(yán)重區(qū)(早期落葉組)隨機(jī)挑選3株梨樹,每株選取3枝帶有葉片的1～2年生果枝整枝(不含新梢),放于樣品袋中。從清洗過(guò)的枝條樣本上取長(zhǎng)、寬均為0.3～0.5 mm的葉柄離區(qū)組織,去除芽,取葉柄和枝各一半,樣品包括離區(qū)細(xì)胞及鄰近的細(xì)胞,用于石蠟切片觀察和赤霉素、抗氧化酶及活性氧的測(cè)定。

于2018年6月14日、7月4日、7月24日、8月14日、8月21日、9月4日在江蘇省南京市浦口區(qū)江浦實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)取樣。‘豐水’梨樹齡15年,長(zhǎng)勢(shì)一般,株行間距2～3 m,常規(guī)管理,落葉率50%～60%。采集早期落葉嚴(yán)重的‘豐水’梨樹葉柄離區(qū)組織,用于石蠟切片觀察。

于2018年和2019年9月至11月,在江蘇省南京市溧水區(qū)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地選取樹齡4年、長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)落葉情況發(fā)生的‘豐水’梨樹,正常管理,立地條件同南京市浦口區(qū)江浦實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng),用于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑噴施處理及外源噴施不同濃度赤霉素對(duì)葉柄離區(qū)抗氧化酶和活性氧影響試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 葉柄離區(qū)解剖結(jié)構(gòu)觀察將葉柄離區(qū)樣品浸泡在FAA固定液(38%甲醛5 mL、冰醋酸5 mL、70%乙醇90 mL)中,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊與切片、脫蠟、染色(甲苯胺藍(lán)染色法)、封片、鏡檢后,觀察正常樹與早期落葉嚴(yán)重樹的葉柄離區(qū)在細(xì)胞組織形態(tài)上的差異,以及發(fā)生落葉梨樹葉柄離區(qū)的動(dòng)態(tài)變化。

1.2.2 赤霉素、活性氧含量及抗氧化酶活性測(cè)定將‘豐水’梨葉柄離區(qū)從枝條上取下后,立即用液氮速凍,-80 ℃保存?zhèn)溆谩３嗝顾睾繙y(cè)定采用Chen等[26]的方法?？寡趸竅過(guò)氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)]活性及活性氧[過(guò)氧化氫(H2O2)和超氧陰離子]含量采用蘇州科銘生物技術(shù)有限公司的相關(guān)試劑盒測(cè)定。

1.2.3 葉片保留率統(tǒng)計(jì)于2018年和2019年9月至11月在江蘇省南京市溧水區(qū)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地,選取27株樹勢(shì)相當(dāng)、長(zhǎng)勢(shì)良好的‘豐水’梨樹,用4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行葉面噴施處理,每6～8 d噴施1次,每年6次。每株隨機(jī)選取樹冠外側(cè)4個(gè)不同方向生長(zhǎng)健壯的枝條(不含新梢),處理前統(tǒng)計(jì)每個(gè)枝條的葉片數(shù),每隔6～8 d統(tǒng)計(jì)1次。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑分別為0.4和0.8 g·L-1乙烯利(ETH),0.5和1.0 mg·L-1赤霉素(GA3),0.3和1.0 mg·L-1脫落酸(ABA),0.3和0.6 mg·L-1生長(zhǎng)素(IAA),以清水為對(duì)照,每個(gè)激素水平處理3株樹。葉片保留率=葉片數(shù)/最初葉片總數(shù)×100%。

1.2.4 赤霉素處理后抗氧化酶活性及活性氧含量測(cè)定于2019年10月8日至10日在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)白馬基地隨機(jī)選取‘豐水’梨樹不含新梢、生長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯枝條,帶回實(shí)驗(yàn)室后將長(zhǎng)度修剪為40 cm,放置于裝有清水的燒杯中,每4 h使用GA3(0.5 和1.0 mg·L-1)噴施葉片,以清水處理為對(duì)照,共處理28 h,光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h,溫度(25±1)℃。處理完成后采集枝條葉柄離區(qū)置于-80 ℃保存,用于活性氧相關(guān)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016、GraphPad Prism 7和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制。2組獨(dú)立樣品顯著性檢驗(yàn)使用t測(cè)驗(yàn),多組樣品顯著性檢驗(yàn)使用One way-ANOVA方差檢驗(yàn)和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘豐水’梨葉柄離區(qū)的組織形態(tài)觀察

由圖1可見(jiàn):‘豐水’梨早期落葉組的葉柄離區(qū)組織發(fā)生了明顯的縊縮現(xiàn)象,離區(qū)的細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小且具有密集的細(xì)胞質(zhì)。同一時(shí)期,正常生長(zhǎng)樹(對(duì)照組)的離層維管束完整,而脫落嚴(yán)重樹的葉柄離層維管束有斷裂趨勢(shì),說(shuō)明早期落葉組與對(duì)照組的葉柄離區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異明顯。由圖2可見(jiàn):離區(qū)處離層細(xì)胞比鄰近細(xì)胞小并且具有密集的細(xì)胞質(zhì)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),離層細(xì)胞逐漸變小或被水解破壞,維管束寬度變窄,這可能為葉柄斷裂脫落提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 ‘豐水梨’對(duì)照組與早期落葉組葉柄離區(qū)石蠟切片對(duì)比Fig.1 Comparison of sectioned paraffin sections of control and early leaf abscission groups of ‘Hosui’pearA.對(duì)照組葉柄離區(qū)Petiole abscission zone of control group;B.早期落葉組葉柄離區(qū)組織Petiole abscission zone of early leaf abscission group.右側(cè)是左側(cè)圖中方框部分的放大圖。The right panel is an enlargement of the rectangle part of the left figure.

圖2 早期落葉‘豐水梨’在葉柄發(fā)育過(guò)程中離層細(xì)胞的形態(tài)變化Fig.2 Morphological changes of abscission zone during petiole development in early leaf abscission‘Hosui’pearA—F表示采樣日期分別為06-14、07-04、07-24、08-14、08-21、09-04時(shí)的葉柄離區(qū)。標(biāo)尺=200 μm。A-F indicate the petiole abscission zone collected date on 06-14,07-04,07-24,08-14,08-21,09-04,respectively. Bar=200 μm.

2.2 ‘豐水’梨葉柄離區(qū)內(nèi)源赤霉素、活性氧含量及抗氧化酶活性的變化

由圖3可見(jiàn):相比對(duì)照組,早期落葉組葉柄離區(qū)的赤霉素合成途徑中關(guān)鍵中間體GA12含量極顯著下降55.38%;具有生物活性的GA3和GA4含量也有所減少,分別降低了83.78%和43.59%,且GA3含量與對(duì)照組相比達(dá)極顯著水平,GA1在落葉組樣品中含量低于檢測(cè)限,未能檢出。

圖3 ‘豐水’梨對(duì)照組和早期落葉組葉柄離區(qū)的赤霉素含量變化Fig.3 Changes of gibberellin(GA)content in control group(CK)and early leafs abscission group of ‘Hosui’pear** P<0.01. The same as follows.

由圖4可見(jiàn):與對(duì)照組相比,早期落葉組葉柄離區(qū)活性氧含量及抗氧化酶活性在籍田鎮(zhèn)與黃土鎮(zhèn)的梨樹樣品中均存在顯著差異。早期落葉組葉柄離區(qū)的SOD、POD和CAT活性在2個(gè)城鎮(zhèn)的梨樹樣品中均顯著低于對(duì)照組,SOD分別降低53.71%和30.95%,POD 分別降低44.88%和75.82%,CAT分別降低62.09%和70.15%。早期落葉組葉柄離區(qū)中的超氧陰離子和H2O2含量都顯著高于對(duì)照組,其中,2組早期落葉組中,H2O2含量分別增加22.09%和99.08%,超氧陰離子含量分別增加36.29%和21.00%。

圖4 ‘豐水’梨對(duì)照組與早期落葉組葉柄離區(qū)的抗氧化酶活性和活性氧含量變化Fig.4 Changes of the antioxidant enzymes activities and the reactive oxygen species(ROS)contents in control group and early leaf abscission group of ‘Hosui’pear*P<0.05.

2.3 外源噴施植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘豐水’梨葉片脫落的影響

噴施外源激素的2年試驗(yàn)表明:GA3可延遲葉片脫落進(jìn)程,0.5和1.0 mg·L-1赤霉素處理均可提高葉片保留率,而1.0 mg·L-1赤霉素處理后葉片保留的時(shí)間更長(zhǎng)(圖5)。噴施1.0 mg·L-1赤霉素后37和34 d時(shí),梨樹葉片的保留率增加最為明顯,2018年和2019年分別比對(duì)照增加1 023.08%和65.56%。而噴施不同水平的ETH卻使葉片脫落加速。0.3和1.0 mg·L-1ABA處理后早期落葉組的葉片數(shù)低于對(duì)照組。IAA對(duì)‘豐水’梨葉片落葉影響較小。

圖5 2018和2019年噴施不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘豐水’梨落葉的影響Fig.5 Effects of various plant hormones on leaf abscission of ‘Hosui’pear in 2018 and 2019

2.4 外源噴施不同質(zhì)量濃度赤霉素對(duì)‘豐水’梨葉柄離區(qū)抗氧化酶活性和活性氧含量的影響

由圖6可見(jiàn):隨著噴施濃度的增加,葉柄離區(qū)SOD和CAT活性增強(qiáng)。0.5 mg·L-1GA3處理對(duì)SOD和CAT活性影響較小,而1.0 mg·L-1GA3處理后,SOD和CAT活性均顯著高于對(duì)照,分別提高45.96%和119.41%。隨著GA3質(zhì)量濃度的增加葉柄離區(qū)超氧陰離子含量逐漸降低,而H2O2含量無(wú)明顯變化。表明GA3質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1時(shí)抑制葉片脫落較好。

圖6 GA3處理‘豐水’梨葉柄離區(qū)對(duì)抗氧化酶活性和活性氧含量的影響Fig.6 Effect of GA3 treatment on the antioxidant enzymes activities and the ROS content in abscission zone of ‘Hosui’pear不同字母表示處理間在0.05水平上差異顯著。Different letters indicate the significant differences between treatments at 0.05 level.

3 討論

植物器官脫落與赤霉素密切相關(guān),劉妮等[27]研究結(jié)果顯示,高水平的赤霉素濃度可以抑制梨萼片脫落。本研究結(jié)果表明,赤霉素處理可以顯著增加‘豐水’梨樹葉片保留率。與正常組相比,早期落葉組的葉柄離區(qū)有效赤霉素含量顯著降低,甚至未能在葉柄離區(qū)中檢測(cè)出具有生物活性的GA1,而且活性氧含量及主要抗氧化酶的活性均存在顯著差異。此外,赤霉素處理后,發(fā)現(xiàn)葉柄離區(qū)中超氧陰離子和H2O2含量明顯降低,而SOD和CAT活性顯著升高,這與郭紹霞等[28]研究結(jié)果一致。由于赤霉素可以調(diào)控ROS產(chǎn)生,而ROS是導(dǎo)致植物發(fā)生細(xì)胞程序性死亡(PCD)的關(guān)鍵信號(hào)分子[29],從而調(diào)節(jié)植物器官的脫落[30],因此推測(cè)GA-ROS-PCD信號(hào)通路參與調(diào)控梨樹葉片脫落過(guò)程,可以針對(duì)赤霉素和活性氧2個(gè)主要靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)調(diào)控梨樹葉片脫落的藥劑。

梨樹的早期落葉受諸多因素影響,如氣候條件、病蟲害、品種特性、管理水平、樹勢(shì)等。本研究中,成都梨園出現(xiàn)的早期落葉現(xiàn)象可能是由于管理水平的差異,而在南京江浦實(shí)驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)發(fā)生早期落葉的梨園,進(jìn)行常規(guī)管理也出現(xiàn)了早期落葉,可能是部分梨樹株行距較窄,樹冠郁閉,樹勢(shì)較弱。非病害引起的‘豐水’梨出現(xiàn)的早期落葉均表現(xiàn)為葉柄離區(qū)的赤霉素含量減少,抗氧化酶活性降低,活性氧含量升高。因此推測(cè)赤霉素可能通過(guò)促進(jìn)抗氧化酶活性的提高,使組織細(xì)胞有較強(qiáng)的活性氧清除能力,減少活性氧在體內(nèi)的積累,增強(qiáng)自身的防御能力,減輕對(duì)細(xì)胞的損害,以推遲植物PCD過(guò)程,延緩葉片脫落。

在本研究中,由非病蟲害引起的早期落葉可以通過(guò)外源噴施赤霉素提高離區(qū)的抗氧化能力,延緩梨早期落葉的發(fā)生,‘豐水’梨樹的最佳GA3處理濃度為1.0 mg·L-1。部分赤霉素氧化基因家族的表達(dá)由活性赤霉素來(lái)反饋調(diào)節(jié)[31-32]。GA1作為在高等植物中主要的活性赤霉素,在發(fā)生早期落葉的葉柄離區(qū)中未能檢出,可能是赤霉素在不同組織中有一定的特異性。此外,赤霉素對(duì)器官脫落過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)能否產(chǎn)生影響、產(chǎn)生何種影響以及赤霉素與活性氧調(diào)控的分子機(jī)制,還需進(jìn)一步研究。赤霉素除了通過(guò)抗氧化酶影響PCD信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程,是否還影響其他生物過(guò)程進(jìn)而影響脫落,還需更深入的探討。