王黎榮　王旭超　田?！⊥跫獤|　徐久春

摘 要：采用薄層色譜法對護(hù)腎安膠囊中的丹參、黃芪、黃芩進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對丹參酮ⅡA含量進(jìn)行定量檢測.丹參酮ⅡA在進(jìn)樣量（0.008 27～0.165 40μg）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2=1.000 0）;平均回收率為97.12%，RSD為1.38%.本方法操作簡單便捷，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適用于護(hù)腎安膠囊中丹參、黃芪、黃芩的薄層鑒別及丹參酮ⅡA的含量測定.

關(guān)鍵詞：TLC;丹參酮ⅡA;HPLC;含量測定

[中圖分類號(hào)]R917?? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Determination of Tanshinone in Hushen'an Capsules andTLC Identification of Main Medicines

WANG Lirong1，WANG Xuchao2，TIANG Hai2，WANG Jidong2，XU Jiuchun2

（1.Pharmacy Department，The People's Hospital of Lingao County，Sanya 571800，China;Collegeof Pharmacy，Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China）

Abstract：TLC method for the main ingredient in compound kidney capsule qualitative identification of salvia miltiorrhiza and radix astragali，radix scutellariae;Using high performance liquid chromatography（HPLC） method was carried out on the main content of tanshinone type ⅡA in medicine salvia miltiorrhiza quantitative detection.Tanshinone type ⅡA in sample quantity（0.008 27～0.165 40μg） range，good linear relationship （r=1.000 0）;The average recovery was 97.12%，RSD was 1.38%.This method is simple and convenient operation，accurate，reliable and suitable for compound interest of salvia miltiorrhiza and radix astragali，radix scutellariae in renal capsule thin layer identification and determination of the content of tanshinone type ⅡA.

Key words：TLC;tanshinone ⅡA;HPLC;determination

護(hù)腎安為一經(jīng)驗(yàn)處方，臨床上對腎臟病輕中度蛋白尿、腎小球腎炎等慢性疾病具有較好的治療效果，多年臨床應(yīng)用證明其療效穩(wěn)定可靠.該處方由丹參、川芎、黃芪、黃芩、姜黃等10味藥材組成，具有扶正固本、補(bǔ)腎安神、標(biāo)本兼顧的作用.丹參是護(hù)腎安膠囊中的主藥，它的主要成分丹參酮ⅡA有顯著抗炎作用，含量較高，是丹參藥材含量測定的控制指標(biāo).本研究將對處方中主要藥材丹參、黃芪、黃芩進(jìn)行薄層鑒別，建立主要活性成分丹參酮ⅡA含量測定方法，為最終質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的確立提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

試藥及試劑 丹參酮ⅡA對照品（110768-201719），丹參對照藥材（120923-201614），黃芪甲苷對照品（110781-201714），黃芩苷對照品（110715-201718），以上均購于中國食品藥品檢定研究院.甲醇（20190308，Sigma），純化水（20191212，市售），試劑均為分析純.

儀器 日本島津高效液相色譜儀（N2000型，日本），分析天平（Sartorius BPZ110，上海），超聲波清洗儀（KQ2200，佛山），數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9000，上海），電熱恒溫水浴鍋（DK-S26，上海），薄層色譜攝影儀（GoodSee-Ⅱ，北京），紫外分光光度計(jì)（UV-2450，上海），硅膠G薄層板（10 cm×10 cm×0.3 mm，青島）.

1.2 丹參的薄層鑒別

1.2.1 溶液的制備

（1）取護(hù)腎安膠囊內(nèi)容物約1 g，研細(xì)，加25 mL乙醚，超聲20? min，過濾，重復(fù)操作2次，揮干溶劑，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，得供試品溶液.

（2）取丹參對照藥材0.1 g，按供試品處理方法進(jìn)行操作，得對照藥材溶液.

（3）取對照品丹參酮ⅡA適量，加入乙酸乙酯配制成濃度為0.01 mg/mL的對照品溶液.

（4）取處方中不含丹參的其他所有藥材，按照護(hù)腎安膠囊工藝流程制備成陰性對照品，取1 g，按供試品處理方法步驟進(jìn)行操作，得陰性對照品溶液.

1.2.2 色譜條件

薄層色譜法[1]試驗(yàn).吸取上述四種溶液各5 μL，在同一塊硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，以苯-乙酸乙酯（19∶1）作為展開劑（預(yù)飽和0.5 h），展開，取出，晾干，在日光燈下進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖1.

1.3 黃芪的薄層鑒別

1.3.1 溶液的制備

取護(hù)腎安膠囊內(nèi)容物2 g，研細(xì)，加甲醇30 mL，加熱回流2 h，過濾，揮干溶劑;往殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，放冷，然后用乙醚連續(xù)萃取2次，每次20 mL，合并乙醚液.用正丁醇（水飽合）振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇提取液.繼續(xù)用氨試液提取2次，每次30 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，最后殘?jiān)眉状? mL溶解.10 ℃以下放置過夜，分層，取下層溶液作為供試品溶液.取對照品黃芪甲苷適量，加甲醇制備成濃度為0.01 mg/mL的對照品溶液.取處方中不含黃芪的其他所有藥材，按照護(hù)腎安膠囊工藝流程制備成陰性對照品，取1 g按供試品處理方法步驟進(jìn)行操作，得陰性對照品溶液.[2-4]

1.3.2 色譜條件

薄層色譜法試驗(yàn).吸取上述三種溶液各2 μL，在同一塊硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，用三氯甲烷∶甲醇∶水=13∶7∶2的混合液作為展開劑，展開，取出，晾干，在365 nm的紫外燈下進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖2.

1.4 黃芩的薄層鑒別

溶液的制備 取護(hù)腎安膠囊內(nèi)容物約1 g，研細(xì)，加人30 mL乙酸乙酯∶甲醇=3∶1的混合溶液，加熱回流30 min，放冷，濾過，揮干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，離心，取上清液做為供試品溶液.取對照品黃芩苷1 mg，加甲醇制備成濃度為0.02 mg/mL的對照品溶液.取處方中不含黃芩的其他所有藥材，按照護(hù)腎安膠囊工藝流程制備成陰性對照品，取1 g，按供試品處理方法步驟進(jìn)行操作，得陰性對照品溶液.[3-5]

色譜條件 薄層色譜法試驗(yàn).吸取上述三種溶液各2 μL，在同一塊硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，用甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=12∶4∶1.5∶3的混合液作為展開劑（展開劑需預(yù)飽和0.5 h），展開，取出，晾干，用10%硫酸乙醇混合液作為顯色劑顯色，加熱至斑點(diǎn)清晰，在日光燈下進(jìn)行觀察.結(jié)果見圖3.

1.5 丹參酮ⅡA含量測定

丹參為處方中主藥之一，主要含有隱丹參酮、丹參酮類化合物、丹酚酸類化合物等成分，其中丹參類化合物具有較強(qiáng)的抗炎作用，含量較高，對臨床安全用藥具有指導(dǎo)意義.本研究以丹參類化合物丹參酮ⅡA作為評價(jià)指標(biāo)，對護(hù)腎安膠囊的含量進(jìn)行測定.[6]

色譜條件 采用SHMASZU C18（250×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以甲醇-水（80∶20）作為流動(dòng)相，檢測波長為270 nm，柱溫為室溫.理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算，不低于5 000.

溶液的制備 取丹參酮ⅡA對照品，精密稱定，加甲醇制備成濃度為0.025 mg/mL的溶液，用微孔濾膜（0.20 μm）過濾，取續(xù)濾液作為對照品溶液.取護(hù)腎安膠囊內(nèi)容物2 g，按“丹參薄層鑒別方法”中供試品的處理方法進(jìn)行操作，干燥后殘?jiān)尤胍合嗟牧鲃?dòng)相使其溶解，定容到25 mL，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液.按“丹參薄層鑒別方法”中陰性的處理方法進(jìn)行操作，干燥后殘?jiān)右合嗟牧鲃?dòng)相溶解，定容到25 mL，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為陰性對照溶液，即得.[7]

專屬性實(shí)驗(yàn) 取陰性對照溶液、對照品溶液、供試品溶液，依次按色譜條件進(jìn)針，結(jié)果見圖4-6.

線性試驗(yàn) 分別取丹參酮ⅡA對照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，依次注入高效液相色譜儀，測得峰面積為縱坐標(biāo)，以丹參酮ⅡA對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

精密度試驗(yàn) 吸取同一供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)5次，按色譜峰面積積分值計(jì).

重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)膠囊劑，共5份，制備成供試品溶液，分別進(jìn)樣測定.

穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，分別于0，6，12，18，24 h測定，按色譜峰面積積分值為指標(biāo)，進(jìn)樣量為5 μL.

回收率試驗(yàn) 取同法測定已知含量的供試品5份，精密加入對照品測定，計(jì)算回收率.

樣品的含量測定 取中試實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的三批樣品，制備成供試品溶液，測定含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參、黃芪、黃芩薄層鑒別結(jié)果

丹參的薄層鑒別結(jié)果見圖1.圖1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在與對照藥材和對照品色譜圖對應(yīng)的位置上，供試品色譜圖表現(xiàn)出相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，故將其列入標(biāo)準(zhǔn)正文.

黃芪薄層鑒別結(jié)果見圖2.圖2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照品色譜圖對應(yīng)的位置上，供試品色譜圖顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾，故

1.供試品 2.對照藥材 3.對照品 4.陰性對照? 1.供試品 2.對照品 3.陰性對照??? 1.供試品 2.對照品 3.陰性對照圖1 丹參的薄層鑒別圖2 黃芪的薄層鑒別圖3 黃芩的薄層鑒別

將其列入標(biāo)準(zhǔn)正文.

黃芩薄層鑒別結(jié)果見圖3.圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：供試品色譜圖上，與對照品色譜圖相應(yīng)的位置顯現(xiàn)出相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，故將其列入標(biāo)準(zhǔn)正文.

2.2 丹參酮ⅡA含量測定

丹參酮ⅡA含量測定系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4-6. 圖5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA在33 min處出現(xiàn)色譜峰，供試品溶液在相同時(shí)間出現(xiàn)色譜峰，陰性對照品的色譜圖在丹參酮ⅡA相應(yīng)的保留時(shí)間附近無干擾峰，證明復(fù)方中其他成分在該色譜條件下對丹參酮ⅡA的色譜峰無影響.樣品的平均含量為0.27 mg/粒，考慮到藥材產(chǎn)地、儲(chǔ)存、運(yùn)輸及自然條件變化對丹參藥材質(zhì)量的影響，暫定本品每粒膠囊含丹參以丹參酮ⅡA（C33H40O15）不得少于0.20 mg.

依法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=4 912.2X-1.305 6.進(jìn)樣量（0.008 27～0.165 40 μg）范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（R2=1.000 0）.供試品溶液按精密度檢測方法進(jìn)樣檢測，峰面積RSD=0.40%，證明儀器精密度良好，數(shù)據(jù)可靠.供試品溶液按重現(xiàn)性檢測方法進(jìn)樣檢測，峰面積RSD=1.17%，證明本法重現(xiàn)性良好.不同取樣點(diǎn)供試品溶液峰面積RSD=0.57%，證明供試品溶液至少24 h內(nèi)穩(wěn)定.平均回收率為98.52%，RSD為1.38%，證明此方法可行.