沈闊程 陳倩文 齊 梅 彭子嘉 樊軍鋒 余仲東

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌712100； 2. 中國(guó)科學(xué)院植物研究所 北京100093)

楊樹(Populus) 是重要的速生造林樹種，廣泛用于風(fēng)沙治理、防止水土流失、涵養(yǎng)水源等方面。同時(shí)楊樹也是現(xiàn)代生物質(zhì)能源的重要樹種之一，用于能源化工、木材制漿業(yè)(Boyleetal., 2010; Xiaetal., 2017)。松楊柵銹菌(Melampsoralarici-populina)所引起的楊樹葉銹病嚴(yán)重影響著楊樹生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致楊樹過早落葉并延遲翌年的萌發(fā)，縮短楊樹生長(zhǎng)周期導(dǎo)致楊樹后期木材生長(zhǎng)不足和木質(zhì)化不良，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Freyetal., 1997)。楊樹銹病可嚴(yán)重阻礙楊樹的生長(zhǎng)，其中根冠降低可達(dá)17%～46%，葉干質(zhì)量降低21%～66%，直徑生長(zhǎng)降低1%～35%(Stochlovaetal., 2016)。此外，葉銹病還會(huì)破壞楊樹自身防御系統(tǒng)，使其遭受蟲害、凍害、根部或干部病害等災(zāi)害。葉銹病的發(fā)生嚴(yán)重影響楊樹的健康生長(zhǎng)，已成為制約楊樹人工林產(chǎn)業(yè)的重大問題(Barresetal., 2008; Wanetal., 2013; Persoonsetal., 2014)。

松楊柵銹菌是典型的長(zhǎng)史型銹菌，生活史包括5個(gè)孢子堆階段(Wanetal., 2015; Ullahetal., 2017)。其中，夏孢子階段對(duì)楊樹具有反復(fù)侵染的特點(diǎn)，危害性最強(qiáng)。循環(huán)侵染中夏孢子萌發(fā)長(zhǎng)出芽管，芽管在葉表蠟質(zhì)層上匍匐生長(zhǎng)并通過氣孔侵入到葉片，分化形成侵染絲侵入氣孔下囊。侵染絲在葉肉組織內(nèi)進(jìn)一步分化形成初生菌絲。初生菌絲細(xì)胞表面具有可識(shí)別楊樹葉肉細(xì)胞信號(hào)的功能，導(dǎo)致菌絲與葉肉細(xì)胞相互作用，形成吸器母細(xì)胞，并最終發(fā)育成吸器，建立活體專性寄生關(guān)系(Finketal., 1991； Allenetal., 1991)。目前，針對(duì)松楊柵銹菌的研究大多集中在寄主楊樹的防御信號(hào)的傳導(dǎo)、細(xì)胞壁的強(qiáng)化、局部細(xì)胞的死亡程序、R、Mer、Rus楊樹抗病基因功能驗(yàn)證(Dowkiwetal., 2004)等方面。但大量研究表明，楊樹固有的結(jié)構(gòu)特征對(duì)抵抗其入侵也同樣具有重要作用，可視為林木在抗銹病侵染中的第一道防線。田呈明等(2001； 2002)研究發(fā)現(xiàn)，楊樹葉片氣孔的大小及密度等葉表特征會(huì)影響寄主對(duì)葉銹病的抗性； Pambou等(2018)認(rèn)為，楊樹葉片蠟質(zhì)的形態(tài)、硬度、疏水性等物理性質(zhì)對(duì)松楊柵銹菌侵染具有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過調(diào)查29種無性系楊樹抗銹病的差異，并進(jìn)一步采用光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡、透射電鏡，觀察并分析了葉片物理結(jié)構(gòu)與抗銹性的相關(guān)性，為楊樹抗銹病品種的快速篩選提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料包括29種楊樹無性系，其中卜氏楊(Populuspurdomii)、川楊(P.szechuanica)、青楊(P.cathayana)、小葉楊(P.simonii)4種楊樹來自秦嶺火地塘試驗(yàn)基地，其余楊樹無性系來自陜西渭河教學(xué)試驗(yàn)站的半同胞家系(藕丹等， 2017)。

1.2 試驗(yàn)方法

2018年9月21日對(duì)采自西北農(nóng)林科技大學(xué)秦嶺火地塘試驗(yàn)基地的卜氏楊、青楊、小葉楊、川楊無性系進(jìn)行松楊柵銹菌發(fā)病情況調(diào)查及葉片采集； 2018年9月25日對(duì)西北農(nóng)林科技大學(xué)渭河試驗(yàn)站的25種楊樹無性系進(jìn)行調(diào)查及葉片采集。

1.2.1 葉片表面夏孢子堆密度 參考沈闊程(2019)方法，以單位面積葉片上夏孢子堆數(shù)目為單位，評(píng)估楊樹感病程度。

1.2.2 葉片縱切面相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 參照Yi等(2010)、沈闊程(2019)制作楊樹葉片超薄切片，利用透射電鏡下測(cè)定下表皮細(xì)胞厚度、上表皮細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度、葉片的總厚度、柵欄組織與海綿組織中細(xì)胞密度。

1.2.3 蠟質(zhì)厚度及下表皮細(xì)胞壁厚度測(cè)定 參照Wan等(2015)方法制作超薄切片，在透射電鏡下測(cè)定蠟質(zhì)厚度與下表皮細(xì)胞壁厚度。

1.2.4 活性氧(H2O2)測(cè)定 用二氨基聯(lián)苯胺(DAB，Amresco)對(duì) H2O2的產(chǎn)生位點(diǎn)進(jìn)行染色，定位在顯微鏡下觀察侵染位點(diǎn)處H2O2情況(Thordal-Christensenetal., 1997； 王晨芳， 2008)。

1.2.5 葉片表面結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 使用干燥法制備樣品(Zhangetal., 2005； Jetteretal., 2016)，在掃描電鏡下測(cè)算相鄰氣孔間距離、閉合氣孔長(zhǎng)度、葉片表面蠟質(zhì)粗糙度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS22.0進(jìn)行楊樹上夏孢子堆密度的Euclidean聚類，運(yùn)用GraphPad Prism 8.0繪制楊樹葉片各指標(biāo)Violin圖，分析其分布。運(yùn)用GraphPad Prism 8.0繪制指標(biāo)間的相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹葉表夏孢子堆密度在無性系間差異性

通過不同無性系楊樹葉片間的夏孢子堆密度Euclidean距離進(jìn)行聚類(圖1)。其中毛白楊(P.tomentosa)、銀白楊(P.alba)聚為一類，其感病程度為0，無夏孢子堆產(chǎn)生，為非寄主組(Group1)； 69楊(P.deltoidescv. I-69； ♀)與青楊(♂)的雜種一代(F1)、青楊、卜氏楊、小葉楊歸為一類，其夏孢子堆密度最大感病程度最為嚴(yán)重，為易感病組(Group2)； 剩余14種無性系楊樹感病程度居中單獨(dú)聚為一類，主要包括69楊、歐美楊(P. ×euramericana)、69楊(♀)與歐美楊(♂)雜種一代(F1)、紅葉楊(P.deltoidescv. Zhonghuahongye)等，為抗病寄主組(Group3)。根據(jù)各無性系楊樹的遺傳背景及分派標(biāo)準(zhǔn)，白楊派(Sect.Leuces)楊樹為松楊柵銹菌的一種非寄主，單獨(dú)分支； 青楊派(Sect.Tacamahaca)為松楊柵銹菌的易感病寄主，黑楊派(Sect.Aigeiros)為該銹菌較強(qiáng)抗性寄主。此外，69楊與青楊的雜種一代(F1)抗銹病能力接近青楊派楊樹為易感病寄主，69楊與歐美楊雜種一代(F1)抗銹病能力接近于歐美楊的抗性，雜交楊樹品種抗銹性受父本的抗銹性影響大。

圖1 不同無性系楊樹松楊柵銹菌夏孢子堆密度系譜Fig.1 Cluster map based on uredinial density in different poplar clones69青、69歐分別表示母本♀為69楊，父本♂為青楊和歐美楊的雜種一代(F1)； 其中，父本♂花粉分別是2008年采自秦嶺東部、中部、西部的混合花粉，并由 1、2、3表示。Both P. deltoides cv. I-69× P. cathayana and P. deltoides cv. I-69× P. ×euramericana mean P. deltoides cv. I-69 is maternal, P. cathayana and P. ×euramericana are paternal; the pollen of P. cathayana and P. ×euramericana was collected in 2008 from the eastern, central and western Qinling Mountains, and marked as 1,2,3, respectively.

2.2 楊樹葉片組織結(jié)構(gòu)差異性分析

下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度、蠟質(zhì)粗糙度、閉合氣孔長(zhǎng)度在2.1所分的3類不同感病程度楊樹群體間均具有顯著的差異(圖2)，其中青楊派易感病組(Group3)的蠟質(zhì)厚度及下表皮細(xì)胞壁厚度最小，白楊派非寄主楊樹(Group1)的最大，黑楊派抗病寄主組(Group2)居中。在寄主楊樹中，青楊派易感病組(Group3)的上表皮細(xì)胞厚度顯著小于黑楊派抗病組(Group2)； 寄主楊樹(Group2、Group3)中，葉片總厚度、下表皮細(xì)胞厚度、海綿組織厚度指標(biāo)顯著大于白楊派非寄主楊樹(Group1)； 寄主楊樹(Group2、Group3)的柵欄組織厚度、相鄰氣孔間距離及海綿組織細(xì)胞密度指標(biāo)則顯著小于白楊派非寄主楊樹(Group 1)。在楊樹的感病程度分類中，除川楊被歸為抗性寄主外，各無性系楊樹葉片結(jié)構(gòu)均與其派別分類和抗性基本相符(圖1)。葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)在3組不同感病楊樹群體之間具有較大的離差，其主要原因是根據(jù)感病程度所分的組中包含有眾多無性系，不同無性系間也具有一定的差異。

圖2 楊樹無性系葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的小提琴圖及差異Fig.2 Violin plot of histological index of poplar leaf

綜合不同基因背景楊樹(所有試驗(yàn)楊樹)葉片結(jié)構(gòu)與感染葉銹病的相關(guān)性分析表明： 下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與葉表夏孢子堆密度具顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.747，-0.473，圖3)。閉合氣孔長(zhǎng)度、柵欄組織厚度、海綿組織細(xì)胞密度、下表皮厚度與葉表孢子堆密度具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(r=0.577，0.757，0.569，0.720)。69楊與歐美楊雜種F1代半同胞家系中，蠟質(zhì)厚度、下表皮細(xì)胞壁厚度與相鄰氣孔間距離具有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.431，-0.586)； 海綿組織厚度與葉表夏孢子堆密度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.197)。69楊與青楊的雜種一代(F1)半同胞家系中，下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與葉表夏孢子堆密度也顯著的負(fù)相關(guān)(r=-0.665，-0.245)； 海綿組織細(xì)胞密度、相鄰氣孔間距離與葉表夏孢子堆密度顯著的正相關(guān)(r=0.182，0.374)。因此，下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度在所有試驗(yàn)楊樹中均與葉表夏孢子堆密度具有顯著的負(fù)相關(guān)性(圖3)，這表明下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與楊樹抗銹病能力具有一個(gè)穩(wěn)定的正相關(guān)關(guān)系。

在銹菌侵染的過程中，松楊柵銹菌芽管可以通過氣孔和已破損的蠟質(zhì)層直接穿透侵入葉片內(nèi)部(圖4A)。此外銹菌芽管在葉表生長(zhǎng)過程中對(duì)蠟質(zhì)層具有一定的溶解作用從而直接穿透蠟質(zhì)保護(hù)層，所以蠟質(zhì)層的厚度也直接決定著芽管穿透蠟質(zhì)而侵入的難易程度(圖4B)。通過DAB-HCl染色觀察到楊樹葉肉細(xì)胞受到銹菌感染時(shí)在細(xì)胞壁周圍會(huì)積累大量的H2O2，抵御銹菌的入侵(圖5)。楊樹下表皮細(xì)胞壁不僅物理防御對(duì)銹菌的侵染還通過調(diào)節(jié)植物的生理生化反應(yīng)對(duì)銹菌同樣具有重要的防御作用。下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與抗銹性具有正相關(guān)關(guān)系。以卜氏楊、毛白楊、69楊為代表，透射電鏡顯示(圖6)： 易感病寄主卜氏楊下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度，非寄主毛白楊最大，抗病寄主69楊居中，與下表皮細(xì)胞壁厚度、蠟質(zhì)厚度與抗銹性具有正相關(guān)關(guān)系的結(jié)論相符，進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)論的普遍性。

圖3 楊樹葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)與感染松楊柵銹菌產(chǎn)生夏孢子堆密度的相關(guān)分析Fig.3 Correlation analysis between leaf structure and uredinial density on poplarsA. 29種供試楊樹 29 clones of tested poplar; B. 69楊×歐美楊半同胞家系 Half-sib families of P.deltoides cv. I-69 and P. × euramericana; C. 69楊×青楊半同胞家系 Half-sib families of P. deltoides cv. I-69 and P. cathayana.

圖4 松楊柵銹菌通過氣孔和穿透蠟質(zhì)層進(jìn)入葉片內(nèi)部侵染69楊Fig.4 The infection process of the germ tube via stomata or cuticle on the leaf surface of P. deltoides cv. I-69紅色箭頭代表通過氣孔侵染楊樹葉片； 藍(lán)色箭頭代表通過破損的蠟質(zhì)層或者溶解蠟質(zhì)層而侵入楊樹到楊樹內(nèi)部。 Red arrow indicated the germ tubes penetrated by stomata and the blue arrow indicated the germ tube penetrating the cuticle directly or germ tubes merging with each other.

圖5 松楊柵銹菌侵染過程中楊樹葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁周圍積累大量H2O2Fig.5 Accumulation of a large amount of H2O2 around the cell wall of poplar leaf cells during the infection of Melampsora larici-populina

圖6 卜氏楊(A)、69楊(B)、毛白楊(C)葉片蠟質(zhì)及下表皮細(xì)胞壁厚度(背面)Fig.6 The thickness of cuticle and lower epidermal cell walls (hypophyllous) of P. purdomii(A), P. deltoides cv. I-69(B) and P. tomentosa(C)

3 討論

松楊柵銹菌嚴(yán)重影響楊樹的生長(zhǎng)，已逐漸成為阻礙楊樹人工林產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素(Wanetal., 2013)，利用雜種優(yōu)勢(shì)篩選抗銹性楊樹品種是生產(chǎn)中通用做法。本研究通過對(duì)29種楊樹無性系發(fā)病情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雜交種的抗銹性主要來自其父本的抗性差異，且不同派別楊樹及其雜交楊無性系對(duì)松楊柵銹菌抗性具有顯著的不同，其中青楊派楊樹及其雜交品種為易感病寄主，黑楊派楊樹具有較強(qiáng)抗銹性，白楊派楊樹為松楊柵銹菌的非寄主。Stochlova等(2016)與Pinon等 (2006)報(bào)道的黑楊派與青楊派雜種葉表疏水性較低，更貼近于青楊派樹種，致使葉表濕度顯著提高有利于銹菌夏孢子的萌發(fā)與侵入。黑楊派與青楊派雜種在不斷的與黑楊派楊樹回交過程中，其抗銹病能力與葉表濕度均顯著提高，從而使雜交種在抗銹性上更接近黑楊派樹種。本研究也發(fā)現(xiàn)黑楊派69楊與青楊派青楊的雜種一代表現(xiàn)有較強(qiáng)的感病能力。在葉片組織結(jié)構(gòu)差異性分析中，寄主楊樹下表皮厚度、海綿組織厚度、葉片總厚度均顯著大于非寄主楊樹。銹菌在葉表萌發(fā)后，芽管通過氣孔或者直接穿透方式侵入到葉片內(nèi)部，主要在下表皮細(xì)胞和海綿組織細(xì)胞中形成吸器吸取營(yíng)養(yǎng)。在同種楊樹上，葉片海綿組織厚度較厚者可提供充足的營(yíng)養(yǎng)成分，致使產(chǎn)孢量增加，發(fā)病加重(康振生等,1993; 唐志鵬,2006; 李琴, 2010; Yuetal.,2011; 田呈明等,2001)。銹菌在非寄主植物上不能成功建立寄生關(guān)系并形成吸器，故寄主楊樹與非寄主楊樹抗銹病能力差異并不是下表皮厚度、海綿組織厚度、葉片總厚度間的差異所致(Newcombe,2005; Bettgenhaeuseretal.,2014; Wanetal., 2015)。

在葉片結(jié)構(gòu)與抗銹病的相關(guān)分析中，不同基因背景楊樹中有6個(gè)葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)與抗病性具有顯著的相關(guān)性。而在基因背景相近的69楊與歐美楊雜種一代半同胞家系中有3個(gè)結(jié)構(gòu)指標(biāo)與抗銹病具有相關(guān)性，69楊與青楊雜種一代半同胞家系中有4個(gè)結(jié)構(gòu)指標(biāo)與抗銹病相關(guān)，但共性指標(biāo)僅有蠟質(zhì)厚度和下表皮細(xì)胞壁厚度，其他非共性指標(biāo)可能來自不同楊樹間的固有差異但與抗銹病并無穩(wěn)定的相關(guān)性。楊樹葉片氣孔密度和大小間的差異與銹菌侵染是否具有相關(guān)關(guān)系一直存在著爭(zhēng)議。有研究者認(rèn)為，銹菌主要通過氣孔侵入到葉片內(nèi)部，較大的氣孔密度與較大的氣孔結(jié)構(gòu)可以增加病原菌侵入到葉片內(nèi)部的機(jī)會(huì)，同時(shí)也可提高葉片蒸騰速率，加大葉表濕度，促進(jìn)病原菌的生長(zhǎng)(Russinetal., 1997; Heath, 2002; Nicolasetal., 2018)。另一些研究認(rèn)為芽管通過氣孔入侵是一個(gè)隨機(jī)過程，未發(fā)現(xiàn)芽管對(duì)氣孔的趨向性； 并且氣孔直徑一般為20 μm左右遠(yuǎn)大于芽管的直徑(2～6 μm)，均可以保證芽管的順利侵入(Hochetal., 1987; Haworthetal., 2018; Yangetal., 2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，除69楊與青楊的雜種一代(F1)外，葉片氣孔密度和大小與抗銹病能力并不具備穩(wěn)定可靠的相關(guān)性，但在所有試驗(yàn)楊樹中葉片下表皮細(xì)胞壁厚度及葉表蠟質(zhì)厚度與抗銹性間均顯示穩(wěn)定可靠的正相關(guān)性，可在生產(chǎn)實(shí)踐中用做快速篩選抗銹病楊樹的指標(biāo)。芽管還可以通過直接穿透蠟質(zhì)方式侵入葉肉組織，而蠟質(zhì)作為抵御侵染的第一道防線，其厚度的增加可直接增強(qiáng)葉表蠟質(zhì)硬度，使葉片抵御芽管侵入(Yuetal., 2011; Wanetal., 2015)。蠟質(zhì)除可作為物理屏障也是一種復(fù)雜的化合物，其化學(xué)組成成分在抑制病原菌侵染方面也具有重要的影響，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)蠟質(zhì)對(duì)灰霉病(Botrytiscinerea)和葡萄(Vitisvinifera)藤蠟質(zhì)對(duì)白粉病都具良好的防御效果(Bessireetal., 2007; ?zeretal., 2017)； 玉米(Zeamays)粒的果皮蠟質(zhì)具有抑制黃曲霉菌(Aspergillusflavus)生長(zhǎng)的作用(Gembehetal., 2001)。但楊樹葉片蠟質(zhì)抵御松楊柵銹菌侵染的作用機(jī)制目前仍不清楚，并且研究發(fā)現(xiàn)在銹菌的吸器母細(xì)胞形成過程中，表皮細(xì)胞壁會(huì)積累大量超氧自由基、過氧化氫、苯酚及三萜等抑菌物質(zhì)(Heath, 2000； 2002)，因此，蠟質(zhì)厚度與抑菌物積累在楊樹抗銹性調(diào)控作用中的地位和關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過29種不同楊樹無性系對(duì)松楊柵銹菌的感病程度調(diào)查分析得到： 青楊派楊樹為易感病寄主，黑楊派楊樹雖也為松楊柵銹菌寄主但具有較強(qiáng)抗性，白楊派楊樹不受松楊柵銹菌的侵染為非寄主類； 69楊與青楊的雜種一代(F1)半同胞家系楊樹感病性與青楊相似，69楊與歐美楊雜種一代(F1)半同胞家系感病程度與歐美楊相似，說明雜交楊樹抗銹病能力受父本影響更為顯著。楊樹葉片結(jié)構(gòu)差異性分析中，寄主楊樹海綿組織細(xì)胞密度、相鄰氣孔距離及柵欄組織厚度則顯著小于非寄主楊樹； 而下表皮厚度、葉片總厚度、海綿組織厚度顯著大于非寄主楊樹。在寄主楊樹中易感病組上表皮厚度顯著小于抗病組。在所有試驗(yàn)楊樹綜合分析中發(fā)現(xiàn)，楊樹下表皮細(xì)胞壁厚度及葉表蠟質(zhì)厚度與楊樹抗銹病性具有一個(gè)穩(wěn)定可靠的正相關(guān)性，因此在實(shí)際生產(chǎn)實(shí)踐中可通過這2個(gè)形態(tài)指標(biāo)快速篩選抗銹病楊樹。