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替莫唑胺治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的耐藥性產(chǎn)生機(jī)制研究進(jìn)展

2021-01-25 13:44姚婷婷劉夢(mèng)昱趙鵬翔王惠儀楊謝飛YAOMawulikplimiAdzavon
生物技術(shù)進(jìn)展 2021年6期
關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)運(yùn)體膠質(zhì)瘤耐藥

姚婷婷,劉夢(mèng)昱,趙鵬翔,王惠,儀楊,謝飛,YAO Mawulikplimi Adzavon

北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部,北京100124

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性腫瘤,起源于大腦的固有組成細(xì)胞[1],占顱內(nèi)腫瘤的40%~50%。惡性膠質(zhì)瘤約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)惡性腫瘤的80%[2]。美國(guó)腦腫瘤注冊(cè)中心(Central Brain Tumor Registry of the United States,CBTRUS)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,膠質(zhì)瘤年發(fā)病率約為6.4/10萬(wàn)[3],發(fā)病高峰期在70歲后,且5年生存率隨著年齡的增長(zhǎng)呈正態(tài)分布趨勢(shì)[4]。膠質(zhì)瘤按世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為4級(jí),其中Ⅰ、Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤,患者平均存活時(shí)間為3~5年;Ⅲ、Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤,患者平均存活時(shí)間為1~2年[5]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)是惡性膠質(zhì)瘤的最高級(jí)形式[3?4]。由于其異質(zhì)性和滲透性,GBM對(duì)大多數(shù)治療方式的反應(yīng)是不可預(yù)測(cè)的,該病的復(fù)雜性成為了發(fā)展有效治療方法的主要障礙。

目前膠質(zhì)瘤主要采用手術(shù)切除為主,放化療為輔的常規(guī)綜合性標(biāo)準(zhǔn)治療,但常規(guī)治療患者預(yù)后較差。由于膠質(zhì)瘤浸潤(rùn)性生長(zhǎng)模式,手術(shù)切除只能在肉眼可見的范圍內(nèi)進(jìn)行切除,但腦部精微結(jié)構(gòu)要求在不擴(kuò)大切除范圍的基礎(chǔ)上盡可能的將膠質(zhì)瘤切除干凈;且放療易引發(fā)相關(guān)不良反應(yīng),如惡心、嘔吐、脫發(fā)等,嚴(yán)重影響患者的身體健康。此外,替莫唑胺(temozolomide,TMZ)為治療膠質(zhì)瘤的常用化療藥物,但其治療效果受到獲得性耐藥的限制,且其中涉及的治療機(jī)制尚不明確。基于此,本研究通過(guò)分析膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制,旨在為更好地選擇化療藥物和改善GBM的耐藥性提供理論依據(jù)。

1 常用化療藥物的作用機(jī)制

近年來(lái),在臨床上以及科學(xué)研究中,治療膠質(zhì)瘤的藥物較多,其中最常見的烷基化劑包括達(dá)卡巴嗪(dacarbazine,DTIC)、卡莫司?。╟armustine,BCNU)、洛莫司汀(comustine,CCNU)和TMZ,這些藥物或其活性形式會(huì)產(chǎn)生親電甲基重氮離子,在細(xì)胞內(nèi)DNA中發(fā)揮親核試劑的作用,并導(dǎo)致多種加合物的形成,而加合物的分布、半衰期、性質(zhì)和細(xì)胞特性決定了細(xì)胞毒性的程度和產(chǎn)生耐藥的可能性[6]。

TMZ于1995年被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用,是最早被批準(zhǔn)用于臨床治療膠質(zhì)瘤的烷基化藥物,其在正常的胃酸水平下不會(huì)被水解,可穩(wěn)定存在。但TMZ在生理pH下會(huì)發(fā)生水解,導(dǎo)致5-(3-甲基三唑-1-基)咪唑-4-羧酰胺[5-(3-methyltriazol-1-yl)imidazole-4-carboxamide,MTIC]的形成。MTIC進(jìn)一步水解為5-氨基咪唑-4-羧 酰 胺(5-aminoimidazole-4-carboxamide,AIC)和甲基重唑,進(jìn)而與DNA反應(yīng)并釋放甲基基團(tuán),使DNA堿基上帶有1個(gè)甲基基團(tuán)。其中鳥嘌呤N7位置(N7MeG)和腺嘌呤N3位置(N3MeA)是最常見的甲基加合物,分別占總烷基加合物的70%和10%[7]。鳥嘌呤O6位置(O6MeG)雖然只占總DNA甲基加合物的5%,但其具有前誘變和前毒性,因此造成的DNA損害是最嚴(yán)重的。

2 DNA修復(fù)損傷機(jī)制

TMZ對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的DNA造成損傷后,可激活多種耐藥機(jī)制,其中DNA修復(fù)機(jī)制因被化療激活發(fā)揮關(guān)鍵作用。DNA修復(fù)途徑包括直接修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)及堿基切除修復(fù)(base excision repair,BER)。

2.1 直接修復(fù)

TMZ治療膠質(zhì)瘤的主要機(jī)制之一是通過(guò)誘發(fā)鳥嘌呤O6位的甲基化從而導(dǎo)致膠質(zhì)瘤患者死亡。O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methyl guanine DNA methyltransferase,MGMT)是 一 種DNA修復(fù)酶,可通過(guò)去除鳥嘌呤O6位的甲基直接修復(fù)由TMZ引起的病變,其通常在癌癥中過(guò)表達(dá),并與膠質(zhì)瘤化療耐藥性的發(fā)展相關(guān)。此外,MGMT是一種相對(duì)分子質(zhì)量為22 kD的蛋白質(zhì),其在烷基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中可將O6位置上的烷基化加合物轉(zhuǎn)移到自身催化袋中半胱氨酸的殘基上,從而使DNA得以恢復(fù)并使發(fā)揮作用的帶有烷基加合物的MGMT失活。而滅活的MGMT可能被泛素化[8?9],然后通過(guò)蛋白酶體機(jī)制被降解[10]。由于一個(gè)MGMT分子只能修復(fù)一個(gè)烷基加合物,使得每個(gè)細(xì)胞中MGMT分子的總數(shù)和細(xì)胞重新合成MGMT的速率成為細(xì)胞去除DNA O6-烷基鳥嘌呤加合物的限速步驟。因此,化療藥物損傷后的DNA修復(fù)依賴于MGMT的連續(xù)表達(dá)。大多數(shù)MGMT定位于細(xì)胞質(zhì)中,在DNA烷基化損傷后通過(guò)烷基化轉(zhuǎn)移[11]至細(xì)胞核中,但目前其具體機(jī)制尚不清楚。

已有研究者對(duì)正常組織和腫瘤中的MGMT活性進(jìn)行了研究,MGMT有明顯的組織特異性,其在肝臟和結(jié)腸中表達(dá)較高,在大腦中表達(dá)較低[12]。已有研究發(fā)現(xiàn),MGMT啟動(dòng)子甲基化在GBM中是可行的,且與TMZ的良好臨床反應(yīng)相關(guān)[13]。有研究顯示,在替莫唑胺治療后通過(guò)激活各種信號(hào)通路導(dǎo)致MGMT蛋白發(fā)生變化,如激活典型的Wnt/β-catenin信號(hào)級(jí)聯(lián)可誘導(dǎo)MGMT表達(dá),而抑制Wnt信號(hào)可增強(qiáng)烷基化藥物的作用,并恢復(fù)不同癌癥的化學(xué)敏感性[14]。在大鼠肝癌細(xì)胞中MGMT的轉(zhuǎn)錄激活發(fā)生在射線或烷基化劑處理后12~24 h[15]。HeLa S3細(xì)胞中,在使用不同的蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)激活劑處理后MGMT表達(dá)水平增加了3~5倍[16]。MGMT啟動(dòng)子有2個(gè)AP-1結(jié)合位點(diǎn),其缺失會(huì)減弱TPA對(duì)MGMT啟動(dòng)子的激活[16]。除AP-1的調(diào)控外,p53也被證明在電離輻射誘導(dǎo)MGMT基因時(shí)是必需的。如MGMT水平?jīng)Q定了腫瘤易感性,則開發(fā)預(yù)測(cè)性的MGMT分析將是有利的。由于降低MGMT在腫瘤中的活性是可能實(shí)現(xiàn)的,基于MGMT的治療甚至有望擴(kuò)展到許多其他類型的實(shí)體和造血腫瘤。但抑制MGMT的藥物如鳥嘌呤的合成衍生物O6-芐基鳥嘌呤(O6-benzylguanine,O6BG),可抑制MGMT由于其血液毒性和效率低下而受到的阻礙[17],因此,考慮聯(lián)合治療的方案。Bcl-2水平的下降是p53突變細(xì)胞中O6MeG觸發(fā)凋亡的標(biāo)志[18],并且已有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MGMT抑制劑與Bcl-2抑制劑同時(shí)使用是一種可行的策略[19]。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中,O6MeG通過(guò)激活在p53突變的腫瘤中的線粒體和p53控制的Fas依賴通路觸發(fā)凋亡[18]。由于MGMT可明顯抑制細(xì)胞凋亡,增加p53對(duì)膠質(zhì)瘤的反應(yīng),因此,MGMT和p53被認(rèn)為是該腫瘤實(shí)體中O6AA耐藥的預(yù)測(cè)因子[20]。

2.2 堿基切除修復(fù)

N7MeG和N3MeA的甲基化水平占TMZ甲基化總水平的80%以上[7],而BER能快速地進(jìn)行修復(fù),從而促進(jìn)GBM的生存,在TMZ耐藥機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。BER系統(tǒng)是由DNA糖基化酶、核酸內(nèi)切酶、聚合酶和DNA連接酶的多催化反應(yīng)組成。當(dāng)BER的1個(gè)或多個(gè)組分發(fā)生突變時(shí),會(huì)導(dǎo)致BER修復(fù)DNA損傷的能力不足,進(jìn)而導(dǎo)致TMZ對(duì)GBM的細(xì)胞毒性。值得注意的是,與N7病變不同,N3病變?nèi)绮恍迯?fù)將是致命的。BER是由DNA糖基化酶識(shí)別和切除修飾的堿基開始的[21],隨后進(jìn)行修復(fù)合成以恢復(fù)序列。負(fù)責(zé)修復(fù)和去除N3MeA、N7MeG和N3MeG的糖基化酶是N-甲基嘌呤-DNA糖基化酶(N-methylpurine-DNA glycosylase,MPG)[22];且有研究表明,敲除MPG基因的小鼠可存活[23]。在BER的組成成分中,聚ADP核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]被認(rèn)為是一種具有雙重作用的重要酶。PARP-1的抑制導(dǎo)致細(xì)胞中斷裂DNA的積累,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由DNA損傷產(chǎn)生的PARP-1過(guò)度激活導(dǎo)致煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)和 三 磷 酸 腺 苷(adenosine triphosphate,ATP)的消耗,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究表明,酪氨酸激酶抑制劑多韋替尼可下調(diào)患者GBM細(xì)胞中的HMGA 2、BER等成員,從而提高TMZ的敏感性[24]。TMZ與PARP1抑制劑維利帕尼聯(lián)合治療即使在高度TMZ耐藥的GBM細(xì)胞中也可發(fā)揮協(xié)同治療作用[25]。另一種參與BER的重要蛋白是PARP-1。作為對(duì)烷基化劑誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng),PARP-1與DNA單鏈斷裂結(jié)合,形成自聚ADP-核糖化,這使其能與其他蛋白相互作用,如 聚 合 酶(Pol)[26]和XRCC1[27]。PARP-1與FEN-1協(xié)同通過(guò)Pol刺激鏈置換和DNA修復(fù)合成,從而促進(jìn)長(zhǎng)補(bǔ)丁BER[28]。此外,PARP-1還介導(dǎo)XRCC1招募到單鏈斷裂處[29],并保護(hù)DNA修復(fù)中間體免受核酸酶攻擊[30]。

2.3 錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair,MMR)

MMR路徑主要用于防止復(fù)制錯(cuò)誤和不正確插入引起的錯(cuò)配。MMR由MutS和MutL兩部分組成。MutS蛋白是一種錯(cuò)配識(shí)別因子,而MutL介導(dǎo)MutS和修復(fù)復(fù)合體的其他成員如外切酶、解旋酶和聚合酶之間的交叉對(duì)話。MMR系統(tǒng)具有高度的保守性,真核生物中保留多種功能。但在高等生物中,功能更復(fù)雜,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6個(gè)MutS同源物和多種MutL同源物,由于其與酵母減數(shù)分裂后的分離有關(guān),又被稱為MLH或PMS。

在哺乳動(dòng)物中,MSH2和MSH6異質(zhì)二聚體能夠識(shí)別堿基錯(cuò)配[31],而另一對(duì)由MLH1和PMS2組成的異源二聚體被招募到修復(fù)位點(diǎn)調(diào)節(jié)這一過(guò)程。未修復(fù)的O6MeG與胸腺嘧啶配對(duì)而不是胞嘧啶配對(duì),使O6MeG-T被MMR識(shí)別,將胸腺嘧啶從新合成的鏈中移除,且不損傷O6MeG。在下一個(gè)復(fù)制周期中,再次發(fā)生不匹配,并重復(fù)修復(fù)周期。這種無(wú)效的MMR循環(huán)導(dǎo)致復(fù)制叉停止,細(xì)胞試圖分裂,導(dǎo)致雙鏈斷裂。這些雙鏈斷裂對(duì)細(xì)胞有細(xì)胞毒性,所以O(shè)6MeG誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性需要細(xì)胞表達(dá)MMR活性[32],而在無(wú)MMR的情況下,O6MeG錯(cuò)配不被識(shí)別,導(dǎo)致化學(xué)耐藥性。目前鮮有報(bào)道證明在GBM的MMR成分突變,然而,在復(fù)發(fā)性GBM中,MSH6的這種突變導(dǎo)致其表達(dá)量下降,進(jìn)一步證實(shí)了TMZ可以通過(guò)滅活MMR的活性,從而使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生耐藥性。最近有研究表明EGFRvIII+通過(guò)上調(diào)DNA MMR來(lái)增加GBM對(duì)TMZ的敏感性,并導(dǎo)致TMZ治療后DNA雙鏈斷裂數(shù)量增加和明顯的S/G2期阻滯[33]。

3 藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體與TMZ耐藥機(jī)制

在癌癥治療中,藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的過(guò)度表達(dá)通常與多藥耐藥有關(guān)。癌癥化療失敗原因之一是藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體通過(guò)增加化療藥物外排,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物水平降低,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤對(duì)藥物不敏感,并且藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體機(jī)制通常對(duì)多種化療藥物均是有效的。多藥耐藥(mutiple drug resistance,MDR)的機(jī)制涉及到ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette,ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員的高表達(dá),其中最主要的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體有3種,分別為ABCB1(又稱為MDR1或P-糖蛋白)、ABCC1(又稱為MRP1)、ABCG2,其中ABCB1研究最多。

研究已經(jīng)證實(shí)了ABCB1在幾種癌癥中的臨床相關(guān)性,但其他轉(zhuǎn)運(yùn)體的臨床相關(guān)性仍不確定。有研究表明ABCB1基因的破壞會(huì)導(dǎo)致許多組織中藥物水平升高[34]。MDR1位于細(xì)胞膜上,由結(jié)構(gòu)相似的兩部分組成,每一部分均有一個(gè)由6個(gè)疏水跨膜螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembrane domain,TMD)和一個(gè)高度保守的核苷酸結(jié)合域(nucleotide-binding domains,NBD),且MDR1通過(guò)其上2個(gè)NBD與ATP的結(jié)合使ATP水解釋放能量從而完成胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外的功能。已有研究表明,MDR1上任何一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)如果被抑制,MDR1的外排功能也會(huì)受到影響。MDR1的高表達(dá)通常發(fā)生于腫瘤細(xì)胞受到抗腫瘤藥物的刺激后,腫瘤細(xì)胞為了自我保護(hù),則會(huì)刺激MDR1 mRNA水平的高表達(dá),從而使藥物外排量升高。ABCB1的表達(dá)水平與血管浸潤(rùn)性密切相關(guān)[35],同時(shí),ABCB1在最大和最具侵襲性的軟組織肉瘤中表達(dá)最高[36]。此外,MDR1還可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源性與外源性凋亡途徑抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡,降低抗腫瘤藥物的藥效。因此,通過(guò)抑制ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體克服耐藥性仍是研究的重點(diǎn),而開發(fā)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制顯然是一種極其有吸引力的潛在化療輔助手段,但截至目前,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑開發(fā)至第三代在臨床試驗(yàn)上效果仍不佳。

4 展望

清楚地了解TMZ耐藥機(jī)制對(duì)提高GBM患者術(shù)后預(yù)后方面有重要的意義,但臨床實(shí)踐表明,約50%的患者對(duì)TMZ表現(xiàn)出耐藥性。GBM對(duì)抗TMZ的機(jī)制提示,可以針對(duì)GBM的腫瘤特異性DNA修復(fù)漏洞,應(yīng)用特異性耐藥靶點(diǎn)的抑制劑聯(lián)用的方法將有可能提高膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對(duì)TMZ的敏感性,如將MGMT的抑制劑與BER修復(fù)位點(diǎn)(如PARP-1)的抑制劑聯(lián)合應(yīng)用于治療GBM患者理論上是完全可行的,但臨床實(shí)踐表明,當(dāng)PARP-1的抑制劑與DNA損傷藥物共同使用時(shí),會(huì)誘導(dǎo)骨髓抑制,限制了其推廣運(yùn)用。因此,識(shí)別GBM相關(guān)的分子生物標(biāo)志物具有重要意義,這也提示使用有活性但是安全的藥物聯(lián)合方案將是治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的有效途徑。

TMZ治療GBM的耐藥機(jī)制較復(fù)雜,除耐藥機(jī)制外,還存在其他機(jī)制,如GBM干細(xì)胞助力耐藥、自噬、mRNA與LncRNA相互作用降低化療藥物的治療效果等,此外,可能仍有一些機(jī)制目前尚未明確。隨著研究的深入,未來(lái)將會(huì)發(fā)現(xiàn)更多克服耐藥的方法與提高療效的途徑,提高GBM的治療效果,使更多的患者受益。

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