史蕊，張印峰，張瑤佳，張云山*

(1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；2.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，天津 300052)

近年來隨著體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射-胚胎移植(IVF/ICSI-ET)及其衍生技術(shù)的不斷進步，臨床妊娠率顯著提高。傳統(tǒng)移植策略是雙胚胎移植(DET)和多胚胎移植(MET，定義為3個及以上胚胎)，但其代價是多胎妊娠風(fēng)險很高[1]。美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)最新數(shù)據(jù)顯示，2016年輔助生殖技術(shù)(ART)出生嬰兒的多胎妊娠率是全美出生嬰兒的9倍(31.5% vs.3.4%)[2]。多胎妊娠已成為ART最常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，與之相關(guān)的母嬰并發(fā)癥如妊娠期高血壓病、胎盤早剝、早產(chǎn)、產(chǎn)后出血、雙胎輸血綜合征、低出生體重兒、胎兒畸形等的發(fā)生率均顯著高于單胎妊娠，雙胞胎和三胞胎的圍產(chǎn)兒死亡率分別是單胎的4倍和6倍[3]。因此，在ART治療過程中，減少多胎妊娠十分必要。大量研究認(rèn)為單胚胎移植(SET)是避免多胎妊娠的有效途徑[4-7]，并提出在特定的人群中實施選擇性單胚胎移植(eSET)可以在不影響臨床妊娠率的同時顯著降低多胎妊娠率。許多西方國家已廣泛應(yīng)用eSET，國內(nèi)生殖中心也在逐漸增加其使用，但目前國內(nèi)尚無統(tǒng)一指南。本文將從以下幾個方面分別闡述，為今后的臨床實踐提供參考。

一、eSET應(yīng)用的現(xiàn)狀

美國輔助生殖技術(shù)協(xié)會(SART)將eSET定義為存在一個以上的高質(zhì)量胚胎，每周期僅移植一個優(yōu)質(zhì)胚胎[1]。1999年，Gerris等[8]對eSET進行了前瞻性臨床研究，對預(yù)后良好的人群應(yīng)用eSET，可使不孕夫婦獲得與正常夫婦相似的持續(xù)妊娠率，并有效降低多胎風(fēng)險。此后，許多國家紛紛規(guī)定或鼓勵生殖中心在合適的條件下應(yīng)用eSET。

1.立法層面：2003年瑞典立法規(guī)定除特殊情況外，原則上每個周期只能移植1枚胚胎。同年，比利時法律規(guī)定<36歲的女性第1次IVF治療周期必須行eSET。因此歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(ESHRE)2003年的年度報告顯示，7個國家共7 155個周期實施eSET，其中比例最高的國家是瑞典(55%)，比利時次之(43%)[9]。2009年英國人類受精與胚胎學(xué)會(HFEA)出臺政策規(guī)定生殖中心常規(guī)應(yīng)用eSET，此后英國多胎妊娠率從2008年的26.6%下降至2013年的16.3%，而IVF/ICSI的活產(chǎn)率并未受到影響[10]。2010年土耳其強制規(guī)定，無論胚胎質(zhì)量優(yōu)劣，<35歲的女性首次和第2次IVF周期中最多移植1枚胚胎，≥35歲者最多移植2枚胚胎[10]。同樣地，加拿大從2010年開始在魁北克省對每個移植周期強制實行SET[10]。

2.指南或共識層面：日本、澳大利亞、芬蘭、美國等對eSET的應(yīng)用沒有正式立法。日本婦產(chǎn)科學(xué)會和美國生殖醫(yī)學(xué)協(xié)會(ASRM)分別于2008年和2013年在臨床指南中建議對預(yù)后良好的年輕女性應(yīng)用eSET[9]。美國CDC最新官方數(shù)據(jù)顯示全美eSET應(yīng)用率在35歲以下女性中為42.7%，35～37歲為25.2%，37歲以上為6.7%[2]。我國專家共識推薦在輔助生殖治療過程中應(yīng)用eSET策略[11]，國內(nèi)多家生殖中心已開展SET，部分中心已獲得較好的臨床結(jié)局[6-7]。

隨著各國立法和指南的實施，eSET的應(yīng)用越來越廣泛。由于既往國家ART年度報告中很難區(qū)分eSET和SET，2016年國際輔助生殖技術(shù)監(jiān)督委員會(ICMART)對61個國家和地區(qū)近2 500個生殖中心的調(diào)查顯示全球SET比例從2008年的25.7%上升到2010年的30.0%，雙胞胎出生率在2008年、2009年和2010年分別為21.8%、20.5%和20.4%[12]，以上結(jié)果在不同區(qū)域之間差異較大。另一項世界范圍的ART趨勢調(diào)查顯示，不僅新鮮周期SET被廣泛應(yīng)用，解凍周期SET應(yīng)用率也逐年升高[13]。澳大利亞/新西蘭地區(qū)從2004年的45.3%增長到2013年的84.9%，日本從2007年的55%增長到2012年的80%[13]。雖然國外大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為eSET是IVF患者的最佳選擇，但是基于以下幾方面原因，國內(nèi)臨床上廣泛應(yīng)用eSET仍存在一定阻力[14]：(1)患者對雙胞胎的偏好和對eSET的諸多顧慮，使其產(chǎn)生抵觸心理；(2)目前缺乏判斷胚胎發(fā)育潛力的有效指標(biāo)，即使形態(tài)良好的卵裂期胚胎也有可能無法培養(yǎng)成優(yōu)質(zhì)囊胚；(3)若移植失敗，后續(xù)助孕治療會增加額外的經(jīng)濟和時間成本，患者心理負(fù)擔(dān)也會增加；(4)患者對囊胚體外培養(yǎng)和胚胎冷凍技術(shù)的安全性還存在擔(dān)憂等。

國內(nèi)外專家逐漸認(rèn)識到，IVF治療最理想的結(jié)局是獲得單胎、足月、健康的活產(chǎn)兒，盡量減少雙胎妊娠和相關(guān)的母嬰并發(fā)癥，eSET是達(dá)到此目的最有效的方法[1，11]。近年來，不論是國家立法的強制規(guī)定還是指南共識的鼓勵建議，各國eSET的應(yīng)用率逐年升高，并有部分國家傾向于在解凍周期應(yīng)用。移植策略的轉(zhuǎn)變使全球多胎妊娠率下降，許多北歐國家將多胎妊娠率控制在10%以下，大大降低了新生兒發(fā)病率和死亡率[9]。

二、eSET的優(yōu)缺點

國外許多文獻對卵裂期或囊胚期eSET進行了研究，其中規(guī)模最大、控制最好的是瑞士一項多中心、雙盲、隨機對照臨床試驗(RCT)[4]。該研究將661名年輕女性隨機分為eSET組與DET組，98%的患者進行了卵裂期胚胎移植。通過比較發(fā)現(xiàn)新鮮周期eSET的多胎妊娠率顯著低于DET(0.8% vs.33.1%，P<0.001)；eSET未獲活產(chǎn)的患者進行后續(xù)解凍周期選擇性單胚胎移植(eSFET)后，累計活產(chǎn)率與DET組無統(tǒng)計學(xué)差異(38.8% vs.42.9%，P=0.3)。Dobson等[5]對選擇性單囊胚移植(eSBT)的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，新鮮周期eSBT的臨床妊娠率雖顯著低于DET(41% vs.51.2%，P<0.01)，但兩者活產(chǎn)率相似(33.7% vs.40.8%，P>0.05)。以上研究結(jié)果驗證了eSET的有效性。Cochrane的系統(tǒng)評價[15]通過對多項RCT統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在單次IVF周期中eSET的活產(chǎn)率顯著低于DET[OR=0.48，95%CI(0.39，0.60)，高質(zhì)量證據(jù)]；但經(jīng)過連續(xù)2次eSET(無論2次新鮮周期eSET還是eSET+eSFET)的累計活產(chǎn)率與DET相比，并沒有顯著降低[OR=0.82，95%CI(0.62，1.09)，低質(zhì)量證據(jù)]。目前推薦大多數(shù)IVF患者實施多次eSET移植策略，但高質(zhì)量證據(jù)僅限于預(yù)后較好的年輕患者。既往有回顧性研究發(fā)現(xiàn)在40歲以上的患者中實施eSBT，可獲得與DET相似的臨床妊娠率[33% vs.33%，OR=1.04；95%CI(0.62，1.75)]和活產(chǎn)率[20% vs.22.8%，OR=1.43，95%CI(0.78，2.64)]，提示eSBT在高齡人群中的應(yīng)用似乎是可行的[16]。加拿大學(xué)者對兩種方案RCT的臨床妊娠結(jié)局進行Meta分析發(fā)現(xiàn)，eSET的早產(chǎn)率[RR=0.37；95%CI(0.25，0.55)]和低體重兒出生率[RR=0.25；95%CI(0.15，0.45)]顯著低于DET，且兩者的圍產(chǎn)期死亡率、早期流產(chǎn)率等之間無顯著差異[17]。既往大量的回顧性或隨機臨床研究在不同年齡人群中證明，eSET可獲得不劣于DET的累計活產(chǎn)率，可有效降低多胎妊娠的風(fēng)險，從而改善母嬰不良結(jié)局，且不會使患者早期流產(chǎn)的風(fēng)險增加。

但實施eSET并非沒有缺點。1.臨床因素：雖然玻璃化冷凍技術(shù)已經(jīng)很成熟，但仍有部分胚胎可能在凍存和升溫后無法存活(據(jù)報道有3%～12%左右)[18-19]。盡管如前所述，許多研究認(rèn)為eSET可以顯著降低多胎妊娠率[4-7]，但并不能完全消除多胎妊娠。據(jù)Vega等[20]報道，eSET后多胎妊娠風(fēng)險約為0～2%，與單胎妊娠相比，同性雙胎妊娠中新鮮移植周期比例更高，即新鮮周期移植更有可能造成同性雙胎妊娠[76.5% vs.69.8%，OR=1.4；95%CI(1.02，1.95)，P=0.03)]。在符合DET條件的IVF患者眼中，eSET充其量是一次不必要的嘗試且成本高昂，它可能使患者延遲獲得成功妊娠，且多次宮腔操作有可能導(dǎo)致移植失敗[21]；2.社會因素：有學(xué)者提出雙胎妊娠是IVF-ET中可以接受的并發(fā)癥[21]。部分患者對雙胎的偏好甚至凌駕于安全之上。國外一項問卷調(diào)查顯示，大多數(shù)(58.2%)不孕不育夫婦更愿意一次生育雙胞胎[22]；3.經(jīng)濟因素：所有風(fēng)險都必須與收益相平衡。Hernandez等[23]利用前瞻性臨床實驗結(jié)果分別對eSET+eSFET與DET進行了成本效益評估，發(fā)現(xiàn)兩組持續(xù)妊娠率分別為38.6%和42.2%，每個病人的平均花費分別是5 614.11歐元和5 562.29歐元，因此連續(xù)兩次eSET在效益和成本方面并未優(yōu)于DET。雖然eSET的廣泛應(yīng)用逐漸成為全球趨勢，但其在所有年齡段或所有IVF患者中的全面應(yīng)用及其成本收益仍有待探討。

三、eSET的適用人群

在IVF/ICSI-ET過程中應(yīng)用eSET的益處顯而易見，但選擇合適的患者仍是臨床醫(yī)師的一大挑戰(zhàn)。根據(jù)美國SART與ASRM的指南[24]，以下情況推薦應(yīng)用eSET：1.經(jīng)PGS篩選后移植整倍體胚胎的任何年齡患者；2.年齡<38歲，符合以下任何一項的患者：(1)有可用的凍存優(yōu)質(zhì)胚胎；(2)經(jīng)IVF治療后獲得活產(chǎn)；(3)有可用的凍存囊胚期胚胎；(4)首次FET。3.供卵移植周期中年齡<35歲的受卵者；4.其他可能因多胎妊娠增加嚴(yán)重并發(fā)癥的患者。國內(nèi)專家結(jié)合國情還建議對既往有雙胎妊娠、早產(chǎn)或剖宮產(chǎn)史者及計劃生育二胎者應(yīng)用eSET[11，14]。

四、eSET的胚胎篩選

評估胚胎質(zhì)量是eSET成功的關(guān)鍵，選擇最有可能植入的胚胎可以縮短成功妊娠時間。過去十年，胚胎篩選方法有了很大改進，不僅僅依靠靜態(tài)形態(tài)學(xué)評估。多種鑒別和篩選優(yōu)質(zhì)胚胎的方法(如延時成像、植入前遺傳學(xué)篩查和代謝組學(xué)等)也逐漸應(yīng)用于臨床[25]。

1.胚胎形態(tài)學(xué)：傳統(tǒng)上，篩選最有植入潛力的胚胎主要根據(jù)不同發(fā)育階段的胚胎形態(tài)學(xué)特征。一項大型前瞻性研究顯示，卵裂期胚胎卵裂球數(shù)目、單核卵裂球的比例和碎片程度對預(yù)測活產(chǎn)具有獨立預(yù)測價值[26]。優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎往往具有以下特點：受精后第2天有4～5個卵裂球，第3天至少有7個卵裂球，無多核且細(xì)胞碎片<20%[27]。

然而有證據(jù)表明，基于形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)選擇第2或第3天的優(yōu)質(zhì)胚胎可能并不準(zhǔn)確，導(dǎo)致移植的胚胎在后期出現(xiàn)發(fā)育異常或停滯，因此部分患者需要囊胚培養(yǎng)與移植。囊胚的質(zhì)量分級主要根據(jù)囊胚擴張程度、內(nèi)細(xì)胞團(ICM)和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)的情況進行評價。Bakkensen等[28]評估了上述三個參數(shù)對單囊胚移植(SBT)臨床妊娠和圍產(chǎn)期結(jié)局的重要性。多元logistic回歸分析顯示，除ICM外，囊胚擴張程度和TE均與臨床妊娠和活產(chǎn)相關(guān)。此外，囊胚形成時間是胚胎生長速率的體現(xiàn)，形態(tài)學(xué)評分相似而形成時間不同的冷凍胚胎植入率差異顯著，胚胎生長速率明顯落后于該有的發(fā)育階段說明胚胎發(fā)育潛能差[27]。根據(jù)以上評分標(biāo)準(zhǔn)，理想的囊胚應(yīng)該是在第5天發(fā)育為4AA級囊胚，第6天的胚胎評分應(yīng)該≥5AA[27]。

2.延時監(jiān)測技術(shù)(Time-lapse monitoring Technology，TLT)：TLT是將顯微攝像裝置安裝在胚胎培養(yǎng)箱內(nèi)，以固定頻率對胚胎進行自動攝像[29]。它是一種無創(chuàng)方法，使胚胎學(xué)家無需將胚胎從培養(yǎng)箱中取出就可以評估胚胎質(zhì)量，保證了胚胎培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性[29]。國外一項Meta分析顯示，應(yīng)用TLT篩選胚胎對妊娠結(jié)局有顯著益處，可使臨床妊娠率[OR=1.54，95%CI(1.21，1.97)]和活產(chǎn)率[OR=1.67，95%CI(1.13，2.46)]顯著升高，使早期流產(chǎn)率顯著降低[OR=0.66，95%CI(0.47，0.94)][30]。而最新的Cochrane系統(tǒng)綜述對9項RCT進行分析發(fā)現(xiàn)，TLT在改善臨床妊娠率[OR=0.95，95%CI(0.78，1.16)]和活產(chǎn)率[OR=1.12，95%CI(0.92，1.36)]方面的證據(jù)并不充分[31]。況且該裝置成本非常高，胚胎實驗室使用該技術(shù)會產(chǎn)生額外的固有成本，還需對實驗室人員進行專業(yè)培訓(xùn)等，故ESHRE專家推薦臨床上應(yīng)用TLT進行胚胎篩選之前，臨床工作者要從經(jīng)濟、可操作性等方面充分評估其利弊，選擇合適的評估系統(tǒng)和形態(tài)動力學(xué)參數(shù)等[29]。

3.植入前遺傳學(xué)篩查/植入前非整倍體篩查(PGS/PGT-A)：PGS/PGT-A使臨床醫(yī)生可以在移植前評估胚胎的非整倍性(即染色體數(shù)目異常)，近十年來被逐漸應(yīng)用于eSET胚胎篩選[32]。在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，有多種分子技術(shù)用于確定胚胎染色體倍性，包括熒光原位雜交(FISH)、比較基因組雜交(CGH)、陣列CGH(aCGH)、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、實時定量PCR(qPCR)和下一代測序(NGS)等[32]。Simon等[33]對3 934枚囊胚使用SNP方法進行染色體倍性分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PGS篩選后eSBT與DET的胚胎種植率(69.7% vs.70.3%，P=0.95)、臨床妊娠率(68.6% vs.81.9%，P=0.25)和活產(chǎn)率(61.7% vs.77.6%，P=0.14)之間無顯著差異。Dahdouh 等[34]對多項RCT分析后發(fā)現(xiàn)PGS可顯著改善臨床妊娠率[RR=1.29，95%CI(1.15，1.45)]和持續(xù)妊娠率[RR=1.39，95%CI(1.21，1.60)]。但ASRM的專家認(rèn)為此種方法仍存在多處不足，如遺傳分析造成額外的時間和經(jīng)濟成本、部分胚胎無法培養(yǎng)至囊胚期進行檢測、活檢導(dǎo)致胚胎損害、醫(yī)源性非整倍體以及結(jié)果不準(zhǔn)確性造成健康胚胎的浪費等[32]。Somigliana等[35]對PGT-A的成本效益分析指出，在具有活檢技術(shù)和能力的大型診療中心，對35歲以上女性使用PGT-A篩選胚胎才是劃算的。因此，PGT-A為所有IVF患者篩選胚胎的價值還有待確定。

4.代謝組學(xué)：代謝組學(xué)是利用色譜法、光譜法及質(zhì)譜法等技術(shù)對某一生物或細(xì)胞所有低分子量代謝最終產(chǎn)物(代謝物)進行定性和定量分析，可用于評估不孕女性的卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎活力和子宮內(nèi)膜容受性等[36]。它可以反映基因表達(dá)下游的事件，并提供其他“組學(xué)”技術(shù)無法提供的細(xì)胞內(nèi)新陳代謝的相關(guān)信息[25]。有學(xué)者比較近紅外光譜技術(shù)與常規(guī)形態(tài)學(xué)評分發(fā)現(xiàn)，代謝組學(xué)預(yù)測妊娠結(jié)局更準(zhǔn)確[37]。Liang等[38]發(fā)現(xiàn)利用拉曼光譜法對廢棄胚胎培養(yǎng)液進行胚胎染色體倍性分析，可達(dá)到95.9%的準(zhǔn)確率，預(yù)測效果與PGT-A一致。Iles等[39]在移植前通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)可以簡單、直接、快速地分析胚胎移植時囊胚培養(yǎng)液的消耗，從而快速識別出最佳胚胎。但Cochrane的系統(tǒng)綜述認(rèn)為目前沒有證據(jù)支持或反駁胚胎植入前代謝組學(xué)在ART中的應(yīng)用[36]。因此，今后需要更多、更有力的研究對胚胎代謝組學(xué)進行評估，并探討其對妊娠結(jié)局的影響。

胚胎篩選方法隨著新技術(shù)的發(fā)展有了很大改進，特別是不再僅僅依賴靜態(tài)的形態(tài)學(xué)評估。TLT的應(yīng)用使胚胎學(xué)家能夠在胚胎培養(yǎng)不受干擾的情況下，對胚胎的發(fā)育情況進行評估。從理論上來說，PGS/PGT-A最有可能篩選出整倍體優(yōu)質(zhì)胚胎，改善IVF治療的成功率，但目前的證據(jù)不足以支持其在胚胎篩選領(lǐng)域的全面應(yīng)用。非侵入性的代謝組學(xué)技術(shù)可能會作為胚胎形態(tài)學(xué)評估的補充方法，提高胚胎篩選的準(zhǔn)確性。胚胎篩選經(jīng)典又普遍適用的方法是形態(tài)學(xué)評估，其他新方法在成為ART常規(guī)技術(shù)之前，必須進行安全性、效益、成本等方面的研究[25]。

總體來說，eSET的應(yīng)用在全球范圍內(nèi)有增加趨勢，且解凍周期eSET的應(yīng)用率逐漸升高。大量研究表明，連續(xù)多次eSET可以保持良好的成功率，同時對降低多胎妊娠有明確作用，因此現(xiàn)行政策對預(yù)后良好的患者推薦這一移植策略。但目前阻礙eSET普遍應(yīng)用的因素依然存在，如患者的受教育程度、經(jīng)濟水平、胚胎篩選及胚胎體外培養(yǎng)和凍融技術(shù)的安全性等。今后在臨床工作中需進一步評估eSET對不同年齡及不同預(yù)后女性的影響，不斷完善其適應(yīng)癥并加強患者宣教，選擇準(zhǔn)確高效的胚胎篩選方法，推動eSET的臨床應(yīng)用。