王景文 ，王偲博，陶宏征，高 雪，賈志強，王宇琪，李永忠，劉雅婷

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201)

煙草產(chǎn)業(yè)是云南省的支柱產(chǎn)業(yè)[1]。近年來，煙草上斑萎病毒嚴重，主要癥狀有葉片褪綠、皺縮、壞死斑和植株萎蔫等，導(dǎo)致局部煙區(qū)產(chǎn)量損失在60%以上[2-4]。

正番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV) 屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)[5]，是侵染煙草的惡性病毒之一[6]。2011 年正番茄斑萎病毒被列為世界十大植物病毒之一，僅次于煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)，位居世界第二[7]。TSWV 由三分體基因組結(jié)構(gòu)組成，從小到大分別為S RNA、M RNA 和L RNA[8]。S RNA 正鏈編碼非結(jié)構(gòu)蛋白(nonstructural protein of RNA S，NSs)，互補鏈編碼核殼體蛋白(nucleocapsid，NP)。其中NSs是TSWV 重要的致病因子[9]，既能夠協(xié)助病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，還可以通過結(jié)合siRNA 和dsRNA抑制宿主RNA 沉默、增強其病毒癥狀[10-12]。目前，針對TSWV NSs 研究較少，本研究通過RTPCR、克隆、轉(zhuǎn)化和測序技術(shù)，利用生物信息學(xué)軟件對課題組前期采集的云南不同地區(qū)感染TSWV 的煙草樣品與GenBank 公布的五大洲不同國家茄科作物上TSWV NSs 氨基酸序列進行分析；并且對云南不同地區(qū)煙草TSWV NSs 氨基酸序列進行選擇壓力分析，闡明來自不同地理分布的不同寄主上TSWV NSs 氨基酸序列間的遺傳差異，為今后TSWV NSs 相關(guān)致病機制研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

材料來自課題組前期從云南省玉溪市、昭通市、昆明市、紅河州、曲靖市和楚雄州采集并且已經(jīng)通過鑒定確定感染TSWV 的8 份煙草樣品，采集到的煙草癥狀表現(xiàn)為葉片褪綠、局部壞死、葉片皺縮、壞死斑和植株萎蔫(圖1)。

圖1 感染TSWV 后的煙草癥狀Fig.1 Tobacco symptoms caused by TSWV

1.2 研究方法

1.2.1 RT-PCR 擴增、克隆及測序

用TransZol TM Up 試劑盒 (全式金，北京)，根據(jù)說明書分別提取云南不同地區(qū)8 個煙草樣品的總RNA。用PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，大連)進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。運用Primer 5.0 軟件，設(shè)計1 對TSWV 的S 全序列擴增引物(F：5′-AGAGCAATTGTGTCATAATTTTATTC-3′；R：3′-AGAGCAATTGTGTCAATTTTATTC-5′)進行S 序列PCR 擴增。20 μL PCR 反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa，大連) 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃ 20 s；98 ℃ 10 s，50 ℃ 10 s，72 ℃ 3 min，30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR 反應(yīng)完成后，取5 μL產(chǎn)物進行1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將獲得的PCR 產(chǎn)物按照Bioteke 公司多功能DNA 純化回收試劑盒說明書進行純化，采用Lethal Based Fast Cloning Kit (天根，北京)進行克隆轉(zhuǎn)化后將陽性菌液送往鉑尚生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

將鉑尚生物技術(shù)有限公司測得的云南不同地區(qū)8 個煙草樣品的序列通過MEGA 7.0 呈現(xiàn)序列信息，通過人工方法除去引物及載體序列，最后獲得所擴增的片段核酸序列。在DNAMAN 8.0 軟件下將各個片段進行拼接，并且通過人工校正獲得它們的S 全序列。運用NCBI ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線軟件分析，獲得云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中檢索到來自9 個國家和地區(qū)的3 種茄科作物上31 條TSWV NSs 氨基酸序列 (表1)。應(yīng)用DNAMAN 8.0 軟件，進行云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列與3 種茄科作物上31 條TSWV NSs 氨基酸序列一致性比對分析；再運用MEGA 7.0 軟件通過鄰近法 (neighbor joining，NJ) 對其進行遺傳進化分析，其中Bootstrap 為1 000 次重復(fù)。運用在線軟件The Selecton Server (http://Selecton.tau.ac.il)對8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸位點所經(jīng)歷的進化選擇情況進行分析。

表1 TSWV NSs 氨基酸序列登錄號Tab.1 The accession numbers of amino acid sequences of TSWV NSs

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 結(jié)果

通過RT-PCR 技術(shù)擴增出云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV S RNA 序列，電泳檢測條帶大小約為2 970 bp (圖2)。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 NSs 氨基酸序列一致性分析

圖2 S 片段擴增PCR 結(jié)果Fig.2 The results of S fragment amplification PCR

運用DNAMAN 8.0 軟件進行一致性分析，結(jié)果顯示：云南不同地區(qū)8 個煙草樣品間TSWV NSs 氨基酸序列一致性高達99.4%～100%。云南不同地區(qū)8 個煙草樣品與GenBank 公布來自9 個國家和地區(qū)的煙草、番茄和辣椒上31 個TSWV NSs 氨基酸序列一致性在93.26%～100%之間；其中云南不同地區(qū)8 個煙草樣品與來自中國云南的1 份煙草、2 份番茄、1 份辣椒的TSWV NSs 氨基酸序列一致性最高達到97.68%～100%；與地理關(guān)系較近的韓國3 份番茄、3 份辣椒上TSWV NSs 氨基酸序列一致性次之，為96.21%～99.14%；而與地理關(guān)系較遠的保加利亞且寄主同樣是煙草樣品的TSWV NSs 氨基酸序列一致性最低，達93.26%～96.57%。進一步分析9 個國家和地區(qū)煙草、番茄和辣椒上31 條TSWV NSs 氨基酸序列，結(jié)果顯示：中國煙草(HQ 402595.1)與中國番茄(AEK 28761.1) TSWV NSs 氨基酸序列一致性為100%。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

采用MEGA 7.0 軟件，將云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列與GenBank 中9 個國家和地區(qū)的煙草、番茄和辣椒上31 條TSWV NSs 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3) 顯示：有3 個不同的TSWV NSs 分離物群。第Ⅰ組是來自中國和韓國的TSWV 分離物中NSs，包含煙草、辣椒和番茄寄主；其中，云南不同地區(qū)8 個煙草樣品與同樣來自中國云南煙草、番茄和辣椒TSWV 分離物中NSs 位于同一分支，并且與韓國番茄和辣椒TSWV 分離物中NSs 處于同一大支。第Ⅱ組是來自西班牙、阿爾及利亞和美國的TSWV 分離物中NSs，包含辣椒和番茄寄主。第Ⅲ組是來自南非、土耳其、澳大利亞和保加利亞的TSWV 分離物中NSs，包含煙草、番茄和辣椒寄主。

圖3 根據(jù)TSWV NSs 氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenentc tree based on amino acid sequences of TSWV NSs

2.2.3 選擇壓力分析

通過The Selecton Server 軟件，對云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸位點所經(jīng)歷的進化選擇情況進行分析。由圖4 所示：云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸所經(jīng)歷的進化沒有正向選擇位點，都是純化選擇(即負向選擇)位點。

圖4 TSWV NSs 各個氨基酸位點進化壓力Fig.4 Pressure of each amino acid sites of TSWV NSs

3 討論

本研究結(jié)果表明：不同TSWV 分離物中NSs與其地理來源有明顯的相關(guān)性。TSOMPANA 等[13]對不同地理分布的不同寄主上TSWV編碼的5 種病毒蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)TSWV NSs 與不同地理的分布有關(guān)。馬小方[14]對不同地理分布的梨和蘋果上蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)編碼的外殼(CP)蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)：ASPV 分離物中CP 分布與寄主有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)：胡蔥黃條病毒(Shallot yellow stripe virus，SYSV) 分離物分布與地理分布及寄主都有顯著的相關(guān)性[15]。本研究通過TSWV NSs氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)：云南8 個煙草樣品分別與中國云南煙草、番茄和辣椒上 4 個TSWV NSs 氨基酸序列一致性最高，而且在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為同一支；與地理關(guān)系較近的韓國番茄和辣椒上 6 個TSWV NSs 氨基酸序列一致性次之，在系統(tǒng)發(fā)育樹中位于同一大支，說明這2 個國家TSWV NSs 親緣關(guān)系較近；而與地理關(guān)系較遠歐洲保加利亞同樣是煙草分離物的親緣關(guān)系最遠。這與TSOMPANA 等[13]的觀點相符。但TSOMPANA 的研究僅選取了歐洲和美洲的樣本，而本研究除云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列以外，還選取了來自5 個大洲9 個國家和地區(qū)的31 個TSWV NSs 氨基酸序列，更有力地證明了不同TSWV 分離物中NSs 與其地理來源有明顯的相關(guān)性。此外，我們選取辣椒、番茄和煙草3 種茄科寄主分析TSWV分離物中NSs 分布與寄主的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TSWV分離物中NSs 未明顯按照寄主聚類，并且在中國茄科作物上發(fā)現(xiàn)煙草(HQ 402595.1)和番茄(AEK 28761.1) TSWV NSs 氨基酸序列一致性達到100%，說明不同TSWV 分離物中NSs 與寄主的相關(guān)性不大。這也提示我們，不同病毒種群分布的關(guān)鍵影響因子不同。

經(jīng)典理論表明：若一個基因存在正選擇則證明該基因已經(jīng)開始為了適應(yīng)環(huán)境的巨變有新的功能產(chǎn)生，當(dāng)基因存在強烈的負選擇時，則說明該基因是在穩(wěn)定保持原有的重要功能[16]。云南不同地區(qū) 8 個煙草樣品 TSWV NSs 氨基酸序列中未檢測到正選擇位點，說明在云南不同地區(qū) 8 個煙草樣品 TSWV NSs 穩(wěn)定保持了其增強病毒癥狀、抑制沉默等功能。

4 結(jié)論

通過對云南不同地區(qū)8 個煙草樣品與Gen-Bank 公布來自9 個國家和地區(qū)的煙草、番茄和辣椒上31 個TSWV NSs 氨基酸序列進行比對分析，說明不同TSWV 分離物中NSs 與其地理來源有明顯的相關(guān)性，但跟寄主的相關(guān)性不大。再通過對云南不同地區(qū)8 個煙草樣品間TSWV NSs 氨基酸序列進行比對分析，進一步說明了地理位置相近的地區(qū)TSWV NSs 具有更高的親緣關(guān)系，遺傳變異小，具有一定的穩(wěn)定性。云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 氨基酸序列中未檢測到正選擇位點，說明在云南不同地區(qū)8 個煙草樣品TSWV NSs 穩(wěn)定保持了其增強病毒癥狀、抑制沉默等功能，未受云南不同地區(qū)復(fù)雜氣候的影響而發(fā)生適應(yīng)性進化，這可能對TSWV 保持強侵染性相關(guān)，但仍需進一步研究確定。NSs 是TSWV 重要的致病蛋白，對NSs 序列的分析將為研究TSWV 的致病機制提供理論基礎(chǔ)。