王叢陽，郭文文，王家俊，熊 林，金 寧，王 焱

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，約有15%發(fā)生BRAF基因突變，而BRAF基因突變約90%為BRAF V600E突變。目前對BRAF V600E突變的檢測手段有兩種：免疫組化和分子檢測，分子檢測目前應用較多的是熒光定量PCR技術。本實驗應用免疫組化和實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)技術對結(jié)直腸癌標本BRAF V600E突變狀況進行檢測，并對這兩種檢測方法結(jié)果進行分析，以期評價這兩種方法在結(jié)直腸癌中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年1月～2019年12月南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院病理科存檔的結(jié)直腸癌標本113例，其中男性65例，女性48例，平均年齡69歲。113例結(jié)直腸癌標本均同時行免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E的突變狀況。

1.2 試劑(1)免疫組化試劑：BRAF V600E鼠單克隆抗體(克隆號VE1)、Opti View DAB免疫組化檢測試劑盒、蘇木精染液、返藍染液均購自美國Roche公司。(2)qRT-PCR試劑：核酸提取試劑盒、人類BRAF V600E突變檢測試劑盒均購自廈門艾德生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 手術標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定12～48 h，常規(guī)全自動脫水機脫水，石蠟包埋，經(jīng)全自動切片機3～4 μm厚切片，60 ℃烤片1 h，Ventana全自動免疫組化儀上機檢測。BRAF V600E檢測全自動免疫組化的設置流程：脫蠟76 ℃ 16 min；修復100 ℃ 64 min；一抗孵育37 ℃ 24 min；蘇木精37 ℃ 8 min；返藍37 ℃ 4 min。全自動染色結(jié)束后，將染色后的玻片放在加入洗滌劑的水中清洗，以去除玻片上的油膜，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。結(jié)果判讀：BRAF V600E蛋白陽性細胞胞質(zhì)呈棕黃色。

1.3.2qRT-PCR (1)DNA提?。航?jīng)顯微鏡下觀察，挑選腫瘤細胞占比>50%的組織蠟塊，刮取6～8 μm厚組織4～5片至離心管中，二甲苯脫蠟后按照核酸提取試劑盒說明書提取基因組DNA，提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計測定其濃度和純度，以確保OD260/OD280在1.8～2.0之間。檢測步驟：嚴格依據(jù)試劑盒要求進行上樣檢測，DNA的上樣量為10 ng，每次檢測均設置陽性質(zhì)控品和陰性對照，陽性質(zhì)控品為BRAF V600E突變合成模板，陰性對照為純水。PCR的過程設置為3個階段：95 ℃ 5 min，1個循環(huán)；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個循環(huán)，在第三個階段60 ℃時開始收集突變FAM信號和內(nèi)控HEX信號。突變判讀：首先觀察樣品的內(nèi)控HEX信號應有明顯的擴增曲線，且Ct值在13～21之間，以確定PCR擴增反應成功。如突變FAM信號無明顯的擴增曲線或其Ct值≥28，則判讀為BRAF V600E突變陰性；如突變FAM信號Ct值<28，則判讀為BRAF V600E突變陽性。

1.3.3測序 將提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳割膠純化后進行測序，測序用上游引物序列5′-CTT CATAATGCTTGCTCTG-3′，下游引物序列5′-GTA ACTCAGCAGCATCTCAG-3′。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中BRAF V600E的表達免疫組化結(jié)果顯示，113例結(jié)直腸癌中19例為BRAF V600E陽性，陽性細胞胞質(zhì)呈不同程度的棕黃色著色(圖1)。

圖1 BRAF V600E在結(jié)直腸癌中呈陽性，EnVision法

2.2 結(jié)直腸癌中BRAF V600E突變情況qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，113例結(jié)直腸癌中BRAF V600E突變陽性7例，突變樣本FAM信號Ct值均<28(圖2)。

2.3 測序結(jié)果檢測chr7：140753213-140753458共246 bp，雙向測序結(jié)果經(jīng)軟件分析和人工審查確認突變情況(圖3)，突變陽性者7例。

圖2 qRT-PCR檢測：A.BRAF V600E突變陰性擴增；B.BRAF V600E突變陽性擴增

圖3 結(jié)直腸癌BRAF V600E的測序結(jié)果：A.BRAF V600E突變陽性；B.BRAF V600E突變陰性

2.4 免疫組化和qRT-PCR結(jié)果113例結(jié)直腸癌標本同時應用免疫組化和qRT-PCR技術進行BRAF V600E檢測，其中免疫組化檢測BRAF V600E蛋白表達結(jié)果為不確定12例，陰性82例，陽性19例。不確定診斷例數(shù)占10.62%(12/113)，其中1例經(jīng)qRT-PCR檢測為BRAF V600E突變，11例檢測為未突變；免疫組化陰性檢出率為72.57%(82/113)，免疫組化陽性檢出率為16.81%(19/113)，其中有6例陽性病例經(jīng)qRT-PCR檢測為BRAF V600E突變，13例檢測為未突變。在113例結(jié)直腸癌標本中，qRT-PCR檢測BRAF V600E突變合計7例，未突變106例，無不確定例數(shù)。qRT-PCR陰性檢出率為93.8%(106/113)，陽性檢出率為6.19%(7/113)(表1)。

表1 免疫組化和qRT-PCR檢測113例結(jié)直腸癌標本BRAF V600E結(jié)果

2.5 免疫組化和qRT-PCR檢測結(jié)果比較以測序為金標準，對113例結(jié)直腸癌標本同時進行測序，免疫組化檢測12例不確定診斷病例中，經(jīng)測序檢測BRAF V600E突變1例，未突變11例，測序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致；免疫組化檢測82例陰性標本中，經(jīng)測序檢測結(jié)果均為未突變，與qRT-PCR結(jié)果一致；免疫組化檢測19例陽性標本中，經(jīng)測序檢測13例為BRAF V600E未突變，6例為BRAF V600E突變，測序結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。qRT-PCR檢測同測序檢測結(jié)果的一致性為100%，免疫組化陰性結(jié)果同qRT-PCR、測序結(jié)果的一致性為100%，免疫組化陽性結(jié)果同qRT-PCR、測序結(jié)果的一致性為31.57%(6/19)(表2)。

表2 免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E結(jié)果比較

2.6 免疫組化、qRT-PCR檢測BRAF V600E應用價值比較以測序為金標準，對113例結(jié)直腸癌標本的免疫組化BRAF V600E蛋白表達結(jié)果進行統(tǒng)計，免疫組化的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、假陰性率、假陽性率、準確率分別是100%、86.32%、31.58%、100%、0、13.68%、87.13%；qRT-PCR檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、假陰性率、假陽性率、準確率分別是100%、100%、100%、100%、0、0、100%(表3)。采用配對資料χ2檢驗比較免疫組化和qRT-PCR兩種方法檢測結(jié)直腸癌標本BRAF V600E突變陰陽性的差別，兩者差異有顯著性(χ2=22.17，P<0.000 01，表4)。

表3 以測序為金標準，免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E應用價值比較

表4 免疫組化和qRT-PCR檢測101例結(jié)直腸癌標本BRAF V600E突變陰陽性結(jié)果

3 討論

BRAF V600E突變發(fā)生于第600號密碼子，位于第1 799位的胸腺嘧啶突變?yōu)橄汆堰?T突變?yōu)锳)，致使纈氨酸由谷氨酸替代(V600E)，該突變通過激活MAPK信號通路，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要影響[1]。有研究顯示，BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌患者可以從一線強化療聯(lián)合貝伐珠單抗中獲益[2-3]，應用BRAF抑制劑可提高BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌患者對抗表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)單克隆抗體的敏感性[4]。有學者通過RNA干擾技術抑制BRAF基因，發(fā)現(xiàn)BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌患者其癌細胞生長明顯被抑制，腫瘤細胞的凋亡也增加[5]，這從另一方面證明除外EGFR抑制劑，BRAF V600E突變型是分子靶向藥物更好的治療對象，突變型相對于野生型而言，可能對靶向藥物治療有更高的敏感性[5-7]。另外有文獻報道BRAF V600E突變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability, MSI)密切相關，因此，BRAF V600E突變型結(jié)直腸癌患者可從免疫抑制治療中獲益[8-9]。目前BRAF V600E的突變狀態(tài)是鑒別Lynch綜合征最有效的手段，BRAF V600E突變可排除Lynch綜合征，提示為散發(fā)型結(jié)直腸癌，無BRAF V600E突變則提示Lynch綜合征的可能[10-11]。有研究表明BRAF V600E突變與預后不良明顯相關(P<0.001)，提示BRAF V600E突變結(jié)直腸癌患者有更低的總體生存期[12-13]。了解BRAF V600E的突變狀態(tài)，有利于對結(jié)直腸癌患者進行用藥指導、鑒別診斷和預后管理。

本組中113例結(jié)直腸癌標本同時行免疫組化和qRT-PCR檢測BRAF V600E突變，其中免疫組化陰性檢出率為72.57%，明顯低于qRT-PCR(93.8%)。免疫組化檢測陽性率為16.81%，qRT-PCR檢測陽性率為6.19%，這與以往報道結(jié)果較一致(5%～15%)[14-15]。本組免疫組化檢測的19例陽性標本中，經(jīng)測序證實，僅6例存在BRAF V600E突變，其余13例為假陽性；而qRT-PCR檢測陽性病例，經(jīng)測序證實均為BRAF V600E突變。與qRT-PCR檢測相比，免疫組化檢測存在較高的假陽性。另外，免疫組化應用于BRAF V600E檢測在診斷中存在較高的不確定病例(10.62%)，而應用qRT-PCR無不確定診斷病例。通過本實驗結(jié)果對比分析，應用免疫組化和qRT-PCR這兩種技術檢測BRAF V600E，qRT-PCR較免疫組化在特異度、陽性預測值、準確率方面存在明顯的優(yōu)勢，且qRT-PCR檢測假陽性率也明顯低于免疫組化。經(jīng)過配對χ2檢驗，兩種檢測方法差異有顯著性(P<0.000 01)。但由于本組病例數(shù)的局限，所取得的數(shù)據(jù)有待進一步完善，結(jié)果還待增加樣本例數(shù)進一步證明。

qRT-PCR技術是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號的累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。每次產(chǎn)物擴增都有對應的熒光信號產(chǎn)生，兩者形成線性關系，通過熒光信號的采集可直接對產(chǎn)物進行定量，因此，此方法準確性高，敏感度達1%[16-17]。另外，qRT-PCR是利用靶向引物和熒光探針進行雙重控制，且全封閉單管擴增，無擴增后的處理操作，降低了擴增產(chǎn)物的污染，從而有效降低假陽性的發(fā)生。同時檢測設立了陰性、陽性的內(nèi)外對照，可有效避免假陰性、假陽性現(xiàn)象[18-19]。但qRT-PCR技術對操作人員技術要求較高，需要經(jīng)過專門的PCR培訓及擁有相關的分子生物學知識，實驗條件也更嚴格，需要在標準的PCR實驗室才能進行相關檢測。目前利用qRT-PCR技術檢測BRAF V600E突變在大醫(yī)院實施較普遍，而基層醫(yī)院因為條件限制，對BRAF V600E的檢測多采用免疫組化技術。

免疫組化檢測結(jié)直腸癌中BRAF V600E的表達，其敏感度、特異度、陰性預測值、假陰性率分別為100%、86.32%、100%、0，免疫組化的實驗條件要求相對簡單，省時，而且價格相對低廉，對樣本的要求相比較不嚴格，操作也較容易，對于一般條件的醫(yī)院如果做好質(zhì)控，可以作為BRAF V600E突變狀態(tài)的初篩。但由于腫瘤的異質(zhì)性，在腫瘤內(nèi)部及同一患者不同部位的腫瘤其蛋白表達存在差異，還存在非BRAF V600E蛋白的表達，BRAF基因其他部位的突變，抗體本身含有某些成分與人體發(fā)生的交叉反應，以及免疫組化操作過程中抗體濃度過高、過度修復、顯色時間過長、漂洗不嚴格等因素，均可導致假陽性的發(fā)生。另外，有些標本免疫組化結(jié)果介于陰性和陽性之間，這可能與標本自身含有BRAF V600E蛋白水平較低，或抗體靈敏度低，以及免疫組化操作過程不規(guī)范有關，導致判讀不能確定。因此，免疫組化由于自身技術的限制和操作原因，導致在結(jié)直腸癌BRAF V600E檢測中假陽性和不確定病例較高。經(jīng)本組實驗比較發(fā)現(xiàn)，qRT-PCR技術發(fā)生假陽性現(xiàn)象明顯低于免疫組化，且其特異性和準確率明顯高于免疫組化，qRT-PCR技術檢測結(jié)直腸癌BRAF V600E基因突變優(yōu)于免疫組化。因此qRT-PCR技術是目前結(jié)直腸癌標本檢測BRAF V600E突變的理想方法。