張曉節(jié)，蔣 磊

（安徽省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，合肥 230041）

急性心肌梗死是冠狀動脈急性或持續(xù)性缺血缺氧導(dǎo)致心肌組織壞死。心肌細(xì)胞大量死亡，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。心肌缺血再灌注（myocardial ischemia-reperfusion，MI/R）損傷是指心肌短時間內(nèi)供血不足或停止，之后又恢復(fù)供血，進(jìn)而造成心肌組織損傷的過程[1]。研究表明，導(dǎo)致MI/R損傷的機(jī)制包括細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡、鈣超載，以及過量氧自由基的產(chǎn)生等[2-4]。目前，治療MI/R損傷的有效藥物尚不完全明確。

白藜蘆醇（resveratrol，RSV）是存在于桑樹、花生或朝鮮槐等多種植物中的一種非黃酮類多酚化合物。既往研究證實，RSV能夠通過減少M(fèi)I/R損傷、舒緩血管或者抗動脈粥樣硬化等途徑發(fā)揮保護(hù)心血管系統(tǒng)的作用[5-6]。然而，有關(guān)RSV治療MI/R損傷的具體分子機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于整體構(gòu)想，通過構(gòu)建多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)即關(guān)鍵靶基因，然后以此對疾病的發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)作用機(jī)制進(jìn)行有效預(yù)測。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)信息篩選方法，從RSV治療MI/R損傷的整體分子作用角度出發(fā)，探尋RSV治療的有效靶基因，然后通過動物體內(nèi)實驗驗證RSV治療MI/R損傷的分子機(jī)制，為RSV應(yīng)用于臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量為（200±20）g，6～8周齡，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SCXK（皖）2017-001]。所有大鼠在25 ℃左右、相對濕度為40%～70%的環(huán)境[SYXK（皖）2017-004]中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后進(jìn)行動物實驗。本實驗方案通過安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)（IACUC：20170625006）

1.2 藥物與試劑

RSV粉末（純度高于99%）和戊巴比妥鈉（批號：57-33-0）均購自美國Sigma公司；蛋白質(zhì)印跡法檢測用兔抗caspase-3單克隆抗體（#9662）和小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（#3498）均購自美國Cell Signaling Technology公司，小鼠抗腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）單克隆抗體（15497-1-AP）購自中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；兔抗GAPDH單克隆抗體（AF5009）、一抗稀釋液、二抗稀釋液、HE染色試劑盒和TUNEL染色試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司；小鼠抗TRAIL一抗免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。大鼠血漿中乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）和心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）含量測定用試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 RSV與MI/R損傷靶基因篩選及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）篩選得到RSV有效作用靶基因，然后采用GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）篩選得到MI/R損傷相關(guān)靶基因。最后運(yùn)用R語言軟件包中的VennDiagram程序包，對RSV作用與MI/R損傷相關(guān)的靶基因取交集，再利用Cytoscape軟件（https://cytoscape.org/），導(dǎo)入這些交集基因，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO功能富集分析和KEGG通路分析

運(yùn)用R語言軟件包中的String和Colorspace程序包，對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行GO功能富集分析，并畫出關(guān)鍵基因的富集分析柱狀圖及氣泡圖。使用模糊聚類算法，以注釋共同度為基礎(chǔ)，對基因進(jìn)行聚類計算，得出聚類分值，該分值代表該基因在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要性。然后根據(jù)GO富集分析結(jié)果，運(yùn)用R語言軟件包中的Bioconductor程序包，進(jìn)行KEGG通路分析，得到RSV治療MI/R損傷涉及的主要信號通路。采用超幾何分布設(shè)計法進(jìn)行KEGG富集分析，富集分析的顯著性按照Benjamini-Hochberg校正法進(jìn)行計算。

1.5 動物建模與分組

實驗大鼠隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MI/R組）及藥物治療組（RSV組），每組各10只。采用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，取仰臥位固定，大鼠四肢通過肢體導(dǎo)聯(lián)針與呼吸機(jī)連接，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，分離左側(cè)冠狀動脈。Sham組只穿線不結(jié)扎左冠狀動脈前降支；MI/R組和RSV組結(jié)扎左冠狀動脈前降支約40 min，然后松開結(jié)扎線再灌注2 h。在整個過程中，以缺血時心肌組織變白且心電圖ST段抬高，再灌注時心肌變紅且ST段下降，視為造模成功。RSV組大鼠于舌下靜脈滴注用生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）配制的RSV溶液（10 mg/kg），而Sham組和MI/R組均注射等量的生理鹽水。

1.6 血漿中 LDH、CK和cTnⅠ含量測定

對各組大鼠心臟取血，并將收取的血液放置于抗凝離心管內(nèi)，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上清液。按照試劑盒操作說明書檢測大鼠血漿中LDH、CK和cTnⅠ的含量，酶標(biāo)儀測定吸光度值，以此反映大鼠MI/R損傷后的心肌功能。

1.7 大鼠心肌梗死面積檢測

頸椎脫臼法處死大鼠，取各組大鼠心臟。垂直心臟長軸，順心尖向底部的方向?qū)⑿呐K組織切片，切片厚度為5μm。將切片置于37 ℃、pH為7.4的TTC溶液中染色10 min，然后用4%的多聚甲醛溶液固定。缺血心肌組織呈現(xiàn)白色，正常的心肌組織為血紅色，心肌梗死面積相對百分比＝白色區(qū)域面積/血紅色區(qū)域面積×100%。

1.8 HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)

取大鼠心肌組織，用4%的多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，再用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液梯度脫水，然后用二甲苯進(jìn)行組織透明，最后經(jīng)石蠟包埋，切片。使用HE染色試劑盒，根據(jù)試劑盒操作說明進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)。

1.9 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡

將大鼠心肌組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內(nèi)脫蠟，然后使用二甲苯浸洗2次，每次約5 min。之后用梯度乙醇溶液（100%、95%、80%、70%）清洗各1次，每次約3 min。采用Proteinase K工作液處理心肌組織切片20 min，并在室溫條件下加入細(xì)胞通透液孵育10 min。PBS清洗切片，滴加TUNEL反應(yīng)混合液，反應(yīng)30 min。切片風(fēng)干后，加入50 μL的 Converter-POD，加上蓋玻片，37 ℃孵育30 min。PBS清洗切片后，加入DAB顯色液，孵育10 min，光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目并拍照。細(xì)胞凋亡率（%）＝TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)目×100%。

1.10 免疫組織化學(xué)法檢測TRAIL蛋白表達(dá)

將大鼠心肌組織的石蠟切片置于60 ℃烤箱內(nèi)脫蠟，然后二甲苯浸洗，梯度乙醇溶液脫水。將心肌組織切片置于10 nmol/L的檸檬酸鹽緩沖液中，90 ℃抗原修復(fù)30 min。室溫條件下，自然冷卻并用去離子水緩慢沖洗。采用3%的H2O2溶液孵育10 min后，加入10%的BSA溶液封閉20 min。加入小鼠抗TRAIL單克隆抗體（工作液體積稀釋比例為1∶200），4℃條件下孵育過夜。加入山羊抗小鼠二抗，室溫條件下孵育30 min。滴加DAB顯色液，顯色后拍照，觀察心肌組織中TRAIL蛋白表達(dá)情況。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測caspase-3、Bcl-2和TRAIL表達(dá)

取大鼠心肌組織，PBS潤洗1～2次，加入細(xì)胞組織裂解液（體積比為1∶5），冰上裂解1 h；4℃，12 000×g離心15 min，收集上清液，采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量檢測；然后取心肌細(xì)胞總蛋白30μg，上樣至聚丙烯酰胺凝膠，80 V電泳30 min后，轉(zhuǎn)120 V電泳60 min，溴酚藍(lán)指示電泳至凝膠最底層。依據(jù)蛋白質(zhì)指示marker和目的蛋白分子量大小，切取目的膠條，采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時長2h。用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入兔抗caspase-3單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）、小鼠抗TRAIL單克隆抗體（1∶1 000）和兔抗GAPDH（1∶5 000）單克隆抗體，4℃孵育過夜；再加入對應(yīng)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h；搖床上加入TPBS洗滌3次，5min/次，然后加入顯影液，顯影并拍照。結(jié)果以各目的條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果分析。動物體內(nèi)實驗檢測均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用單因素方差分析方法，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSV作用與MI/R損傷靶基因交集及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通過對RSV作用的128個藥效靶基因和MI/R損傷的1 231個基因靶點(diǎn)進(jìn)行基因交集篩選，得到86個可能與RSV治療MI/R損傷相關(guān)的基因作用靶點(diǎn)（圖1A），其中包括PTGS1、PTGS2、MAOB、RELA、STAT3、AKT1、VEGFA、CCND1、Bcl-2、Bcl-2-L1和caspase-3等。然后通過Cytoscape軟件成功構(gòu)建RSV治療MI/R損傷的相關(guān)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，如圖1B所示。

圖 1 RSV作用靶點(diǎn)和MI/R損傷相關(guān)基因的交集篩選圖（A）及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（B）Figure 1 Intersection screening diagram (A) and regulation network diagram (B) of resveratrol (RSV) target genes and myocardial ischemia-reperfusion (MI/R) damage-related genes

2.2 相關(guān)靶基因的GO富集功能與KEGG富集信號通路

GO富集分析可得到特定功能層次上由基因或蛋白數(shù)目構(gòu)成的有向無環(huán)圖，其中包括分子功能、細(xì)胞組分及生物過程3個方面。如圖2A所示，篩選得到的86個相關(guān)基因主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（repressing transcription factor binding）和激活轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（activating transcription factor binding）等功能。

采用R語言軟件包對篩選得到的86個靶基因進(jìn)行KEGG信號通路富集分析。結(jié)果顯示共有157條信號通路，涉及參與糖尿病并發(fā)癥調(diào)控的AGE-RAGE信號通路、卡波肉瘤相關(guān)性皰疹病毒感染通路和細(xì)胞凋亡信號通路（圖2B）。其中細(xì)胞凋亡信號通路涉及的主要基因包括TRAIL、caspase-3、Bcl-2及Bax等（圖2C）。

2.3 RSV對大鼠心肌功能的影響

如表1顯示，與Sham組相比，MI/R組大鼠的血漿中LDH、CK和cTnⅠ含量均明顯增加（P＜0.01），心肌梗死面積也明顯增大（P＜0.01）；而相比于MI/R組，在給予RSV藥物干預(yù)后，大鼠心肌功能得到明顯改善，血漿LDH、CK和cTnⅠ含量均明顯降低（P＜0.01），心肌梗死面積明顯減少（P＜0.05）。

2.4 RSV對大鼠心肌結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示：Sham組心肌結(jié)構(gòu)正常；MI/R組大鼠的心肌纖維排列紊亂，且部分肌絲斷裂，間隙增寬；相比于MI/R組，RSV組大鼠的心肌纖維排列較為規(guī)則，心肌間隙變小，心肌細(xì)胞變形恢復(fù)較好（圖3）。

2.5 RSV對大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色結(jié)果（圖4）顯示：相比于Sham組，MI/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；相比于MI/R組，RSV組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖5）顯示：相比于Sham組，MI/R組大鼠心肌組織中caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05），而Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05）；相比于MI/R組，RSV組大鼠心肌組織中caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而Bcl-2表達(dá)量明顯增加（P＜0.05）。

圖 2 關(guān)鍵靶向基因的GO富集分析（A）和KEGG富集分析（B）柱狀圖以及細(xì)胞凋亡信號通路圖（C）Figure 2 GO enrichment analysis (A) and KEGG enrichment analysis (B) histogram of key target genes and their related apoptosis signaling pathways (C)

表 1 RSV對MI/R大鼠心肌功能的影響Table 1 The effect of resveratrol (RSV) on the myocardial function of myocardial ischemia-reperfusion(MI/R) damaged rats(x- ± s, n=6)

圖 3 HE染色檢測大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化Figure 3 Morphological changes of rat myocardium tissues after HE staining

圖 4 TUNEL染色檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡（×200）Figure 4 Apoptosis of rat cardiomyocytes after TUNEL staining (×200)

圖 5 蛋白質(zhì)印跡法檢測RSV對心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of resveratrol (RSV) on the expressions of apoptosis-related proteins in rat myocardium by Western blotting

2.6 RSV對TRAIL蛋白表達(dá)的影響

免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果（圖6A）顯示：MI/R組大鼠心肌組織中TRAIL蛋白表達(dá)量增加，而給予RSV藥物處理后TRAIL表達(dá)水平降低。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖6B）顯示：相比于Sham組，MI/R組TRAIL蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；相比于MI/R組，RSV組TRAIL蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。

圖 6 RSV對大鼠心肌組織中TRAIL蛋白表達(dá)的影響Figure 6 Effects of resveratrol (RSV) on the expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL) protein in rat myocardium

3 討論

RSV是一種天然多酚類化合物，廣泛存在于多種植物中，具有抗心血管疾病和抗腫瘤等多種生物活性。以往研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠MI/R損傷模型中，RSV能有效縮短室性心動過速及室顫發(fā)生的持續(xù)時間，改善心肌損傷[7]。另外，RSV也能夠通過抗氧化、抗自由基作用，減少心肌細(xì)胞壞死[8]。RSV還能通過調(diào)控一氧化氮合酶/一氧化氮（NO）通路，促進(jìn)NO釋放，發(fā)揮對MI/R損傷的保護(hù)作用[9]。

已知氧化應(yīng)激在MI/R損傷中扮演重要作用。有文獻(xiàn)顯示，在MI/R損傷大鼠模型中，心肌細(xì)胞線粒體功能出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，活性氧產(chǎn)生量異常增加，導(dǎo)致心肌梗死面積增大；而用RSV預(yù)處理MI/R損傷模型大鼠后，心肌細(xì)胞線粒體功能得到明顯改善[10]。同時，炎性反應(yīng)是MI/R損傷的重要病理生理學(xué)機(jī)制[11]。在MI/R損傷的大鼠模型中炎性細(xì)胞因子水平顯著升高，而給予RSV處理后上述炎性細(xì)胞因子水平明顯降低，提示通過早期的RSV處理抑制炎性反應(yīng)，能夠有效地減輕MI/R損傷[12]。

在上述文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測RSV治療MI/R損傷的關(guān)鍵靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到RSV作用有效基因靶點(diǎn)共128個，用GeneCards篩選得到MI/R損傷相關(guān)靶基因共1 231個，兩者交集后共有86個可能成為RSV治療MI/R損傷的相關(guān)基因，其中包括Bcl-2、caspase-3和TRAIL等。以往研究表明，RSV能夠通過抑制caspase-3活性，促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕MI/R損傷[13-14]。本研究進(jìn)一步采用Cytoscape軟件成功構(gòu)建了RSV治療MI/R損傷的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D，涉及86個關(guān)鍵靶基因。通過GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，關(guān)鍵靶基因主要富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合和抑制轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等生物學(xué)功能，而KEGG通路富集共涉及157條信號通路，其中排在前3位的是參與糖尿病并發(fā)癥調(diào)控的AGE-RAGE信號通路（29/86）、卡波肉瘤相關(guān)性皰疹病毒感染通路（26/23）和細(xì)胞凋亡信號通路（23/86）。而在細(xì)胞凋亡信號通路中涉及23個基因，包括TRAIL、caspase-3和Bcl-2等基因。因此，本研究進(jìn)一步通過大鼠體內(nèi)實驗驗證RSV治療MI/R損傷可能與細(xì)胞凋亡通路及這3個基因表達(dá)有關(guān)。

TRAIL是腫瘤壞死因子超家族成員之一，通過與其不同的受體結(jié)合，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)等病理生理學(xué)過程[15-16]。有文獻(xiàn)顯示，在胰腺癌細(xì)胞系（SW1990、PaTu8988和BxPC3）中，過表達(dá)TRAIL能夠上調(diào)TRAIL受體1和2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[17]；在急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株中，體外聯(lián)合枸杞多糖和TRAIL能夠激活caspase-3活性，增加腫瘤細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性[18]。以上研究結(jié)果共同表明，TRAIL在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。但是有關(guān)TRAIL對MI/R損傷引起心肌細(xì)胞凋亡的作用尚未見報道。因此，筆者基于前期的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果推測，RSV可能通過調(diào)控TRAIL表達(dá)，逆轉(zhuǎn)MI/R損傷。因此，本課題組構(gòu)建了MI/R損傷大鼠模型，探究RSV能否通過抑制TRAIL表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕心肌損傷。HE染色結(jié)果顯示，與MI/R組大鼠相比，RSV組大鼠心肌纖維排列規(guī)則，心肌間隙變小。TUNEL染色結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低。進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MI/R組相比，RSV組caspase-3表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高。為明確RSV能否通過調(diào)控TRAIL表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡，本研究采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法檢測TRAIL蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：相比于Sham組，MI/R組TRAIL表達(dá)量顯著增加，而RSV處理后TRAIL表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果表明，RSV能夠通過調(diào)控TRAIL表達(dá)抑制MI/R心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測以及大鼠體內(nèi)實驗驗證發(fā)現(xiàn)，RSV能夠抑制TRAIL蛋白表達(dá)，降低心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕MI/R損傷；這為今后應(yīng)用RSV治療MI/R損傷提供了新的理論基礎(chǔ)。