孫成成，劉劍剛#，劉美霞#，李 浩，羅增剛

（1. 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院老年病研究所，北京 100091；2. 北京市中醫(yī)管理局，北京 100053）

慢性腦血流灌注不足是導(dǎo)致血管性癡呆（vascular dementia，VaD）的主要因素之一。目前認(rèn)為，VaD是由多種腦血管因素導(dǎo)致的腦組織累積性損傷引起的影響認(rèn)知能力的進(jìn)行性疾病[1]，其特征是思維能力和行為障礙，通常發(fā)生在腦卒中之后[2]。VaD的發(fā)生機(jī)制與炎性因子有關(guān)[3]，其中白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子，與認(rèn)知能力下降、神經(jīng)元毒性和腦細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[4]。實(shí)驗(yàn)性慢性腦缺血研究較為經(jīng)典的動(dòng)物模型是雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎模型[5]，因其能較好地模擬人慢性腦血流灌注不足造成腦組織處于低灌注和低氧狀態(tài)，特別是與認(rèn)知功能有關(guān)的結(jié)構(gòu)如海馬體、皮層等容易發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶和行為能力損害，與人慢性腦缺血的發(fā)生機(jī)制較為一致。

雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎建立腦慢性缺血模型后不同時(shí)程的動(dòng)物行為學(xué)變化和病理改變的程度不盡相同。本實(shí)驗(yàn)比較雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎不同時(shí)程大鼠模型的炎性因子水平、神經(jīng)功能變化和腦組織病理特征，以期為后續(xù)藥物研究時(shí)根據(jù)藥理作用特點(diǎn)選擇較為確切的藥物干預(yù)時(shí)機(jī)提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量為200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK（京）2016-0002]。所有大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室[SYXK（京）2015-0011]，室溫控制在25 ℃左右，相對(duì)濕度為（40～70）%。大鼠自由進(jìn)食和飲水，每日光照和黑暗各12h，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究方案經(jīng)過(guò)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（2018XLC004-1），實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵循國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》和《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南》的要求。

1.2 主要試劑和儀器

ELISA檢測(cè)所用IL-1β試劑盒（批號(hào)20181110）、IL-6試劑盒（批號(hào)20181210）和TNF-α試劑盒（批號(hào)20181112）均購(gòu)自北京欣博盛生物科技有限公司。戊巴比妥鈉（批號(hào)T860907）由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司進(jìn)口分裝，甲醛溶液（批號(hào)C10561782）由上海麥克林生化科技有限公司提供，2,3,5-氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）試劑（批號(hào)CT28181920）由北京酷來(lái)博科技有限公司提供。DR-200BS型半自動(dòng)酶標(biāo)分析儀為無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司產(chǎn)品，Sorvall ST 8R型高速冷凍離心機(jī)為賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品，DpxView Pro型顯微彩色圖像處理系統(tǒng)為丹麥DeltaPix公司產(chǎn)品，Olympus BH-2型顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物造模及分組

參照文獻(xiàn)[6]的方法，進(jìn)行大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎手術(shù)以造模。手術(shù)方法稍做改進(jìn)：腹腔注射2%戊巴比妥鈉水溶液（0.2 mL/100 g體質(zhì)量）后，將麻醉大鼠固定于操作臺(tái)，剃毛備皮，常規(guī)消毒大鼠頸部；沿著頸部正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離，充分暴露大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈，隨即分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及迷走神經(jīng)，然后穿線（4號(hào)手術(shù)絲線）結(jié)扎一側(cè)，停頓15 min后再結(jié)扎另一側(cè)；術(shù)后碘附涂抹術(shù)部皮膚，每日每只大鼠肌內(nèi)注射青霉素（4×104U）抗感染，連續(xù)3d。將造模成功的大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，每組10只，即結(jié)扎后2周組、4周組和6周組。同時(shí)設(shè)立假手術(shù)組，大鼠10只，手術(shù)方法同上，只是穿線后不結(jié)扎，后期處理同模型組。雙側(cè)結(jié)扎模型成功的標(biāo)志：大鼠麻醉清醒后出現(xiàn)Horner綜合征及一段時(shí)間內(nèi)前肢為主的神經(jīng)功能障礙。術(shù)后回籠飼養(yǎng)，在缺血2 h內(nèi)注意觀察，維持大鼠體溫為36.5～37.5 ℃。

1.4 指標(biāo)評(píng)價(jià)

1.4.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照文獻(xiàn)[7]的方法，用5分制進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：大鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，記0分；大鼠出現(xiàn)輕度局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀，左前肢無(wú)法完全伸展，記1分；大鼠出現(xiàn)中度局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀，左前肢無(wú)法正常抓握，記2分；大鼠出現(xiàn)中重度局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀，提尾倒懸時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，記3分；大鼠局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀嚴(yán)重，存在自發(fā)性轉(zhuǎn)圈現(xiàn)象，記4分。分?jǐn)?shù)越高，表明大鼠的神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.4.2 大鼠炎性因子指標(biāo)檢測(cè) 于神經(jīng)功能評(píng)估后，麻醉各組大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，4℃條件下以3 000 r/min的速度離心15 min，收集上層血清，置于－80 ℃凍存?zhèn)溆?。?yán)格按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明，在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各組血清中TNF-α、IL-1β及IL-6對(duì)應(yīng)的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.4.3 大鼠腦組織缺血范圍測(cè)量 腹主動(dòng)脈取血后，每組隨機(jī)編號(hào)并取其中5只大鼠，快速取腦組織，于－20 ℃冰箱中速凍10 min。將大鼠腦組織置入腦切片模具，進(jìn)行冠狀面切片，平均切成5個(gè)腦片。將大鼠腦組織切片置于2%的TTC磷酸緩沖液中，避光37℃溫箱中孵育15 min，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛溶液固定2 h。正常腦組織染成玫瑰紅色，缺血或梗死組織則不染色（呈白色）。將染色的腦組織切片按切片前后順序排列，分別標(biāo)號(hào)和拍照。用DpxView Pro型顯微彩色圖像處理系統(tǒng)測(cè)量腦缺血（梗死）面積和全腦面積，然后計(jì)算缺血區(qū)域所占百分率（腦缺血或梗死面積/全腦面積的值×100%）。

1.4.4 大鼠腦海馬體組織病理學(xué)觀察 取每組另5只大鼠的腦組織，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%的中性甲醛溶液固定、常規(guī)包埋、乙醇梯度脫水和切片后，進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬體神經(jīng)元的病理形態(tài)學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)程模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化

與假手術(shù)組比較，造模后2周組、4周組和6周組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分均明顯升高（P＜0.05），提示雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)功能損傷。與2周組的模型大鼠比較，4周組大鼠的神經(jīng)功能變化仍持續(xù)存在，在6周時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分有所降低（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 不同時(shí)程的模型大鼠血清炎性因子變化

大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后，與假手術(shù)組比較，2周組、4周組和6周組的IL-6水平明顯升高（P＜0.05），而IL-1β和TNF-α水平雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 不同時(shí)程的模型大鼠腦缺血范圍變化

圖 1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后不同時(shí)程的模型大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分Figure 1 Neurological deficit score of the model rats in different duration after bilateral common carotid artery ligation

表 1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后不同時(shí)程的模型大鼠血清炎性因子變化Table 1 Changes of serum inflammatory factors in model rats with different duration after bilateral common carotid artery ligation(pg/mL，，n ＝10)

表 1 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后不同時(shí)程的模型大鼠血清炎性因子變化Table 1 Changes of serum inflammatory factors in model rats with different duration after bilateral common carotid artery ligation(pg/mL，，n ＝10)

注：IL-6為白細(xì)胞介素6，IL-1β為白細(xì)胞介素1β，TNF-α為腫瘤壞死因子α。與假手術(shù)組比較，*P＜0.05。

組 別 炎性因子IL-6 IL-1β TNF-α假手術(shù)組2周組4周組6周組F P 114.75±14.81 151.76±23.07*160.03±26.68*161.77±27.98*3.762 0.041 21.12±7.21 28.04±4.91 30.96±6.43 30.96±6.43 3.037 0.071 67.54±9.13 75.58±11.17 87.28±7.81 80.82±10.37 3.004 0.073

缺血模型建立后，與假手術(shù)組比較，不同時(shí)程的模型大鼠腦組織有不同程度的局部缺血，或形成明顯的梗死灶。與造模2周組（[8.24±2.40）%]比較，4周組（[13.18±4.15）%]和6周組（[17.48±5.13）%]的缺血區(qū)域所占百分率明顯增加（P＜0.01）。與4周組比較，6周組的缺血區(qū)域所占百分率明顯增加（P＜0.01），并有較小的梗死灶。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.4 不同時(shí)程模型大鼠腦組織缺血區(qū)病理學(xué)變化

觀察顯微鏡下相同部位的病理組織形態(tài)，假手術(shù)組大鼠所選腦區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞數(shù)較多，核深染，未見(jiàn)不均一染色質(zhì)（圖3B）；模型組大鼠2周、4周和6周后腦組織缺血區(qū)都有不同程度的損傷。其中，2周組腦組織細(xì)胞間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（箭頭①所示），神經(jīng)元細(xì)胞核壞死（箭頭②所示）（圖3C）；4周組腦組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)減少，疏密不均，白質(zhì)密度降低，邊緣模糊，炎性細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞核壞死增加（圖3D）；6周組腦組織細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞質(zhì)空泡變性，白質(zhì)呈現(xiàn)慢性缺血性改變，細(xì)胞數(shù)明顯減少，局部有梗塞灶出現(xiàn)（箭頭③所示）（圖3E）。

圖 3 雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后不同時(shí)程的模型大鼠腦組織缺血區(qū)HE染色（×300）Figure 3 HE staining of brain tissues of model rats with different duration after bilateral common carotid artery ligation(×300)

3 討論

雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎致慢性腦血流低灌注的主要病理生理基礎(chǔ)是腦組織葡萄糖代謝減少、能量代謝障礙、神經(jīng)元缺陷、神經(jīng)遞質(zhì)改變、膽堿能受體缺失、蛋白質(zhì)合成異常，以及腦白質(zhì)損害等[8]。而慢性腦血流低灌注是各種腦血管疾病和血液動(dòng)力學(xué)異常的常見(jiàn)后果，并可導(dǎo)致退行性認(rèn)知障礙的發(fā)生[9]，引發(fā)VaD和阿爾茨海默病[10]，表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損和行為障礙[11]。慢性腦血流低灌注引起的認(rèn)知功能損傷主要是由腦白質(zhì)病變?cè)斐?，整個(gè)環(huán)節(jié)包括神經(jīng)炎性反應(yīng)、脫髓鞘、髓鞘堿性蛋白缺失等，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的缺失和變性，因而在認(rèn)知功能回路中神經(jīng)元可能直接或間接地參與了作用。有研究顯示，雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后4周的大鼠海馬體CA1區(qū)出現(xiàn)神經(jīng)元缺失，術(shù)后5周發(fā)生顯著的白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)改變和灰質(zhì)萎縮[12]，術(shù)后7周大腦皮層中突觸載脂蛋白E水平升高，突觸蛋白增加[13]。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠在腦血流低灌注的情況下可出現(xiàn)神經(jīng)元損傷，而且慢性腦血流低灌注會(huì)引起不同類型的細(xì)胞變性，在雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）術(shù)后2周～6周大腦皮層和紋狀體的數(shù)量急劇減少，表明這兩個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元易受慢性腦缺血的影響[14]。已知突觸功能障礙是慢性腦血流低灌注誘導(dǎo)認(rèn)知功能缺陷的基礎(chǔ)。神經(jīng)回路中存在沉默突觸，結(jié)扎后沉默突觸所占百分比增加，CA1區(qū)樹(shù)突棘密度顯著下降，樹(shù)突棘密度降低與功能性突觸數(shù)量減少有關(guān)[15]。現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，BCCAO術(shù)后腦血流急劇下降，隨后在4周后恢復(fù)到閉塞前水平[1]。然而，腦血流的恢復(fù)不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性和記憶障礙[16]，因此早期干預(yù)是治療VaD的一種策略。

本實(shí)驗(yàn)采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久性結(jié)扎法制備大鼠腦低灌注模型，在2周、4周和6周腦缺血早期不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察大鼠的神經(jīng)功能變化和組織病理學(xué)改變。結(jié)果顯示，手術(shù)造成大鼠慢性腦缺血：造模后2周開(kāi)始，大鼠腦組織有缺血性損傷，病理結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)壞死，并有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；4周后，腦白質(zhì)密度降低，邊緣模糊；6周后，腦白質(zhì)呈現(xiàn)慢性缺血性改變，局部有梗死灶出現(xiàn)。隨著時(shí)程延長(zhǎng)，腦缺血最終造成機(jī)體神經(jīng)功能障礙。這種現(xiàn)象接近于臨床患者腦血管阻塞后遺癥的病理改變和臨床癥狀。此外，造模2周后，大鼠神經(jīng)功能顯著減退，4周時(shí)減退仍持續(xù)存在。與2周時(shí)比較，大鼠造模6周時(shí)神經(jīng)功能有好轉(zhuǎn)，這可能與大鼠側(cè)支循環(huán)建立有關(guān)。檢測(cè)慢性缺血性炎性反應(yīng)因子水平的結(jié)果顯示，造模2周后血清IL-6水平明顯升高，而4周和6周的炎性反應(yīng)因子水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明局部手術(shù)造模尚未引起全身血清炎性因子的變化，或只是應(yīng)激反應(yīng)，這也可能和側(cè)支血流逐步恢復(fù)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)只是一個(gè)腦血流低灌注不同時(shí)程神經(jīng)功能變化的初步研究，今后將和動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，進(jìn)一步明確慢性腦血流低灌注對(duì)神經(jīng)功能和認(rèn)知行為學(xué)的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，防治慢性腦血流低灌注導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙及腦組織病理生理學(xué)改變時(shí)，術(shù)后2周甚至更早時(shí)間干預(yù)可能是一個(gè)較為合適的選擇，早期干預(yù)可進(jìn)一步防治認(rèn)知功能受損。