黃玉芳，楊麗娟，陳勝輝，劉淑娟，孫迎利

(南昌市生殖醫(yī)院，南昌 330000)

卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)是指將精子直接注射入卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的輔助受精顯微操作技術(shù)，其在嚴(yán)重少精子癥、弱精子癥、畸精子癥，以及經(jīng)皮附睪穿刺取精及睪丸穿刺取精的梗阻性無精子癥患者中得到了廣泛應(yīng)用。ICSI技術(shù)為這些患者帶來了福音，該技術(shù)能夠顯著提高受精率，然而仍有少部分的ICSI周期會發(fā)生完全受精失敗或受精率極度低下的病例[1-2]。在輔助生殖技術(shù)中，激活卵母細(xì)胞是受精中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是生殖醫(yī)學(xué)中的重要研究內(nèi)容，受精失敗最主要原因就是未成功激活卵母細(xì)胞[2-5]。針對ICSI后次日原核觀察發(fā)現(xiàn)完全不受精或者低受精率的周期，目前各大中心并無好的解決方案，該周期基本無可用胚胎。關(guān)于補(bǔ)救性化學(xué)激活卵母細(xì)胞案例更是較少相關(guān)報道[6]?，F(xiàn)將1例因男方少弱精子癥行ICSI，次日原核觀察發(fā)現(xiàn)受精失敗后進(jìn)行卵母細(xì)胞輔助激活(AOA)獲得早期囊胚1枚且新鮮移植，成功順產(chǎn)1名健康男嬰的病例報道如下。

一、病例資料

患者夫婦女方27歲，男方28歲。夫婦二人于2014年生育1名健康女孩。之后女方2015年人工流產(chǎn)1次，2016年自然流產(chǎn)1次。近5年來一直未采取避孕措施，性生活正常規(guī)律，每周1～2次。女方曾于2018年行輸卵管造影(HSG)檢查，提示宮腔正常，左側(cè)輸卵管傘端阻塞粘連，右側(cè)輸卵管峽部阻塞。2019年患者夫婦因不孕癥來我院就診，行宮腹腔鏡探查術(shù)，術(shù)中診斷雙側(cè)輸卵管積水、女性盆腔粘連；術(shù)中行腹腔鏡雙側(cè)輸卵管切除術(shù)和宮腔粘連松解術(shù)，宮腔鏡探查未見明顯異常。女方平素月經(jīng)規(guī)律，周期30 d，經(jīng)期5 d，經(jīng)量中色暗紅無痛經(jīng)，無傳染病史。男方無傳染病史及手術(shù)史，亦無不良嗜好，男科檢查前列腺未見異常，雙側(cè)睪丸大小正常，陰莖及射精功能正常。精液檢查結(jié)果：精子濃度為2×106/ml、活動率為5%、前向運(yùn)動精子率為2%、非前向運(yùn)動精子率為3%，診斷為少弱精子癥。夫妻雙方染色體檢查均正常。

女方促排卵方案為改良超長方案，取卵當(dāng)日共獲卵15枚，其中成熟卵母細(xì)胞10枚、未成熟卵母細(xì)胞5枚。男方于取卵當(dāng)日手淫取精，精液液化后進(jìn)行精液處理，精子濃度低，活動度差。卵母細(xì)胞脫顆粒孵育30 min后取成熟卵母細(xì)胞10枚行ICSI。ICSI過程中卵母細(xì)胞形態(tài)未見異常，其中2枚卵母細(xì)胞無彈性；挑選形態(tài)尚可、活動度好的精子制動后分別注入卵母細(xì)胞內(nèi)，制動和注射過程均順利。次日觀察受精情況，10枚成熟卵母細(xì)胞中的2枚無彈性卵母細(xì)胞退化，其余8枚卵母細(xì)胞未見原核形成。告知患者后建議選擇AOA進(jìn)行受精補(bǔ)救，患者同意補(bǔ)救性AOA措施并簽署知情同意書后，立刻行離子霉素(Ionomycin，Ion)化學(xué)激活。AOA具體操作步驟為：將未受精的卵母細(xì)胞置于含10 μmol/L Ion的取卵-胚胎處理液(G-MOPS Plus，Vitrolife，瑞典)中避光處理10 min，經(jīng)卵裂胚培養(yǎng)液(G1 Plus，Vitrolife，瑞典)洗滌5～6次，然后轉(zhuǎn)入卵裂胚培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。第3天觀察發(fā)現(xiàn)8枚化學(xué)激活的卵母細(xì)胞共有7枚發(fā)生卵裂，其中3級2枚、4級2枚，發(fā)育緩慢3枚。7枚卵裂胚胎全部行囊胚培養(yǎng)，第5天獲得融合胚胎2枚，余退化；第6天2枚融合胚胎中的1枚退化，另1枚發(fā)育成早期囊胚。應(yīng)患者要求進(jìn)行新鮮移植。術(shù)前告知患者移植由AOA發(fā)育而來的囊胚可能存在的風(fēng)險，患者簽署知情同意書并繼續(xù)要求新鮮移植。早期囊胚移植7 d后檢測患者血HCG為33.42 U/L，移植45 d后B超顯示單胎妊娠，胎心胎芽皆可見，最后于孕39+2周剖腹產(chǎn)下1名男嬰，體重4.2 kg，身長50 cm，查體未見異常。

二、討論

未成功激活卵母細(xì)胞是受精失敗的最主要原因[2-5]。Ca2+振蕩在AOA過程中起十分重要的介導(dǎo)作用[7]。目前Ca2+振蕩發(fā)生原理主要集中在受體控制學(xué)說和可溶性精子蛋白學(xué)說兩方面[8-9]。大量研究使用電激活、物理激活或化學(xué)激活等激活方法來增加AOA所需的Ca2+，以成功激活行ICSI后的卵母細(xì)胞[10]?，F(xiàn)各大生殖中心主要使用化學(xué)激活法進(jìn)行AOA[11-13]，因?yàn)榛瘜W(xué)激活劑易購買、質(zhì)量易保證、操作方法簡單易學(xué)易開展，且激活后受精率高、卵裂率高，能夠有效提高周期可用胚胎率。不同的激活試劑的激活原理不同，Ion是一種鏈霉菌屬的抗生素，對Ca2+有高效親和力的離子載體，Ion不是直接引起Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而是通過間接降低細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度來激活卵母細(xì)胞[14]。相比Ca2+載體A23187，Ion的化學(xué)激活功能特異度更高、效果更好，但它的功能還有待進(jìn)一步研究。有研究發(fā)現(xiàn)高濃度Ion會引起Ca2+振蕩頻率與幅度的上升進(jìn)而打破線粒體能量代謝平衡，導(dǎo)致活性氧自由基(ROS)升高和腺苷三磷酸(ATP)下降，從而誘發(fā)DNA損傷、降低囊胚形成率[15]?，F(xiàn)在哺乳動物中廣泛使用的AOA方案中Ion的使用濃度為10 μmol/L，作用時間為10 min。

雖然化學(xué)激活劑能夠改善卵裂率和可用胚胎率，但在臨床使用中仍然存在后代安全性如有害、致畸等方面的質(zhì)疑。Vasilev等[14]運(yùn)用5 μmol/L(相當(dāng)于哺乳動物的10 μmol/L)的Ion作用海星卵母細(xì)胞10 min后發(fā)現(xiàn)，對照組有(88.3±1.4)%卵裂正常，實(shí)驗(yàn)組只有(24.8±10.9)%卵裂正常；實(shí)驗(yàn)組受精卵要么停滯在第1次卵裂期，要么呈現(xiàn)異常卵裂；在隨后的發(fā)育過程中對照組(68.3±16.1)%卵裂胚形成正?？捎媚遗?，而實(shí)驗(yàn)組僅有(16.2±19.3)%卵裂胚形成正?？捎媚遗?。Heytens等[16]對7～12周B6D2F1小鼠進(jìn)行控制性促排卵獲得的卵母細(xì)胞行Ion化學(xué)激活發(fā)現(xiàn)，Ion最佳作用濃度亦為10 μmol/L，但是Ion處理組和對照組在囊胚發(fā)育、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目、囊胚著床率和新生胎鼠參數(shù)如體長、重量、形態(tài)等方面比較均無顯著差異。Norozi-Hafshejani等[17]發(fā)現(xiàn)，相比氯化鍶而言Ion有更強(qiáng)的卵母細(xì)胞激活功能，但是在胚胎發(fā)育上，氯化鍶處理組細(xì)胞碎片率顯著低于Ion處理組，這可能跟二者激活原理有關(guān)，Ion可以引起Ca2+濃度快速升高，而氯化鍶對Ca2+作用比較溫和，只是引起Ca2+濃度的微量、緩慢上升，但兩組胚胎著床率比較并無顯著差異。國內(nèi)檀暢等[12]運(yùn)用氯化鍶激活卵母細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，ICSI聯(lián)合氯化鍶輔助激活15枚成熟卵母細(xì)胞，雖然僅有4枚胚胎正常受精，但是形成了3枚可用胚胎，融胚移植并成功順產(chǎn)1名健康男嬰，其結(jié)果與Norozi-Hafshejani等[17]的研究結(jié)果一致。Nasr-Esfahani等[18]研究發(fā)現(xiàn)，對因男方是重度畸形精子癥而就診的87對夫婦運(yùn)用ICSI聯(lián)合Ion激活卵母細(xì)胞時，行AOA可以有效改善卵裂率并提高可用胚胎率；運(yùn)用植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)技術(shù)對獲得的胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，可獲得含正常染色體的胚胎，成功妊娠1年后隨訪子代，體檢并未發(fā)現(xiàn)子代有身體及智力障礙等問題。Li等[19]發(fā)現(xiàn)ICSI聯(lián)合AOA(ICSI-AOA)雖然可以通過提高生育率和可移植胚胎率來彌補(bǔ)ICSI受精失敗，但是不能顯著提高囊胚形成率、妊娠率和移植率。Vanden Meerschaut等[20]發(fā)現(xiàn)，在由于精子因素導(dǎo)致ICSI受精失敗的案例中行ICSI-AOA能有效改善囊胚形成率和妊娠結(jié)局，而對于非精子因素導(dǎo)致的受精失敗案例則不能影響囊胚形成率和妊娠結(jié)局。

本案例中夫婦雙方曾生育1名女孩且有2次流產(chǎn)史，男方精液檢查為少弱精子癥，且女方亦存在宮腔環(huán)境問題，所以：(1)無法預(yù)先判斷ICSI能否正常受精；(2)直接進(jìn)行ICSI-AOA也不能保證一定受精；(3)該技術(shù)還存在一定的風(fēng)險，故沒有當(dāng)天ICSI后即進(jìn)行AOA技術(shù)。ICSI次日觀察受精失敗后進(jìn)行補(bǔ)救性AOA，受精率顯著提高并獲得可用胚胎，新鮮移植獲得妊娠后成功產(chǎn)下1名健康男嬰。這為我們提供了一個新的思路：ICSI受精失敗后可采取補(bǔ)救性AOA以提高卵母細(xì)胞受精率和可利用胚胎率。但從案例中我們也發(fā)現(xiàn)由于是在ICSI第2天進(jìn)行AOA，存在卵母細(xì)胞老化且胚胎發(fā)育偏慢、優(yōu)質(zhì)胚胎率低等問題。所以，如果該對夫婦還有生育要求，下次可于ICSI當(dāng)日即進(jìn)行AOA，以保證受精率，提高臨床可用胚胎率。

綜上所述，對于ICSI助孕受精失敗的患者，可以實(shí)行補(bǔ)救性AOA方案，以幫助患者獲得可用胚胎。目前臨床上運(yùn)用化學(xué)激活劑進(jìn)行AOA都是個案報道，缺乏大樣本研究加以證實(shí)，且所獲得的胚胎可能存在發(fā)育潛能問題。為保障患者權(quán)益，在向患者介紹該項(xiàng)技術(shù)優(yōu)越性的同時也要向其詳細(xì)說明面臨的風(fēng)險以及對子代健康可能產(chǎn)生的影響，充分尊重患者的選擇。本研究行ICSI后獲得的可用卵母細(xì)胞僅8枚，且沒有設(shè)置對照組進(jìn)行驗(yàn)證，所以后期一方面要對生產(chǎn)的男嬰健康狀況定期隨訪，另一方面要加大研究力度，收集更多病例數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析以探討和評估該技術(shù)的安全性，更好地為患者服務(wù)。