王建偉，李亞男，張國(guó)凱，饒 竹，王國(guó)英，王 迪，岳秀萍

(1.太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024；2.中海國(guó)亞環(huán)保工程有限公司，太原 030012；3.國(guó)家地質(zhì)實(shí)驗(yàn)測(cè)試中心，北京 100037)

焦化土壤中最常見的污染物質(zhì)主要成分是BTEX和其他芳烴類物質(zhì)[1-2]。BTEX屬于單環(huán)芳烴類物質(zhì)，包括苯、甲苯、乙苯和二甲苯，這類物質(zhì)對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用[3]，在人類繁殖生育過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生毒性[4-6]。這些有害物質(zhì)通過(guò)煤氣凈化和焦油加工排放出來(lái)，給周圍土壤環(huán)境帶來(lái)了極其嚴(yán)重的污染。

國(guó)內(nèi)外研究表明，在焦化土壤中，污染物不僅降低了土壤微生物的多樣性，還改變了其群落結(jié)構(gòu)和組成，使得降解性微生物成為了優(yōu)勢(shì)菌群[7]。隨著煤炭深加工對(duì)土壤造成污染的問(wèn)題越來(lái)越受到重視，一些相應(yīng)的土壤治理措施得到應(yīng)用，治理措施主要有3類：物理法、化學(xué)法和生物法[8]。其中，利用土壤中微生物修復(fù)技術(shù)來(lái)治理污染土壤受到了廣泛關(guān)注[9-10]。微生物修復(fù)技術(shù)機(jī)理是土壤中的降解菌群對(duì)污染性有機(jī)物進(jìn)行吸附、降解和轉(zhuǎn)化以降低污染物濃度或使其反應(yīng)生成無(wú)害物質(zhì)。BTEX在土壤中具有垂直遷移滲透能力[11]，當(dāng)其下滲一定深度后，土壤多為缺氧或者厭氧環(huán)境，這就給土壤微生物厭氧降解BTEX提供了條件。在厭氧條件下，甲苯作為BTEX中的簡(jiǎn)單有機(jī)物，可以通過(guò)各種電子受體被微生物降解[9，12]，其中硝酸鹽作為常規(guī)電子受體有很大優(yōu)勢(shì)。苯甲酸作為BTEX反應(yīng)過(guò)程的中間產(chǎn)物[13-14]同時(shí)參與甲苯降解菌液對(duì)照能夠更好分析焦化土壤微生物菌群特性。

因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究在硝酸鹽厭氧條件下，通過(guò)降解甲苯或苯甲酸的反應(yīng)過(guò)程，來(lái)富集焦化廠污染土壤中的微生物。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)手段對(duì)降解菌群結(jié)構(gòu)多樣性和組成進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集

采集山西省太原市小井峪一處廢棄的煤化所焦化廠排污溝內(nèi)覆土10～15 cm以下的土壤樣品。該土壤樣品用于富集厭氧微生物來(lái)進(jìn)行降解試驗(yàn)，取樣后立刻帶回實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存于4 ℃冰箱內(nèi)，直至使用。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基菌液由以下物質(zhì)組成：Na2HPO4·7H2O(7.90 g/L)，KH2PO4(1.50 g/L)，NH4Cl(0.30 g/L)，NaCl(23.00 g/L)，KNO3(0.51 g/L)，MgSO4·7H2O(0.10 g/L)，EDTA(0.25 g/L)，ZnSO4·7H2O(0.12 g/L)，CaCl2(0.03 g/L)，MnCl2·4H2O(0.03 g/L)，F(xiàn)eSO4·4H2O(0.04 g/L)，(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.03 g/L)，CuSO4·5H2O(0.01 g/L)，CoCl2·6H2O(0.02 g/L)，以上培養(yǎng)基均使用超純水進(jìn)行配制，然后通入氬氣(壓強(qiáng)0.4 MPa，15～20 min)來(lái)吹脫溶液中溶解氧。培養(yǎng)基及所用血清瓶、槍頭等操作材料用高壓蒸汽滅菌鍋在121 ℃下滅菌30 min，最終使培養(yǎng)基成為無(wú)菌厭氧實(shí)驗(yàn)條件。

1.2 富集菌液的建立

1.3 化學(xué)分析

1.4 細(xì)菌的多樣性分析

1.4.1細(xì)菌DNA提取和PCR擴(kuò)增

DNA提?。簠⒄誒MEGA試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit使用說(shuō)明書的步驟進(jìn)行操作。提取后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

PCR擴(kuò)增：第一輪擴(kuò)增利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。通過(guò)如下引物進(jìn)行土壤富集菌液細(xì)菌DNA的PCR擴(kuò)增：341F引物，CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物，GACTACHVGGGTATCTAATCC. PCR反應(yīng)體系為2×Taq master Mix 15 μL，PCR primer F (10 μmol/L) 1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，超純水30 μL. PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：在95 ℃條件下擴(kuò)增3 min；94 ℃條件下擴(kuò)增 30 s，45 ℃ 條件下擴(kuò)增20 s，65 ℃條件下擴(kuò)增30 s，做5次循環(huán)；在94 ℃條件下擴(kuò)增20 s，55 ℃條件下擴(kuò)增20 s，72 ℃條件下擴(kuò)增30 s，做20次循環(huán)；在72 ℃條件下擴(kuò)增5 min，最后冷卻至10 ℃.PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，PCR反應(yīng)體系為2×Taq master Mix 15 μL，Primer F (10 μmol/L)1 μL，Primer R (10 μmol/L) 1 μL，Genomic DNA 20 ng，超純水30 μL. PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：在95 ℃條件下擴(kuò)增3 min；在94 ℃條件下擴(kuò)增20 s，在55 ℃條件下擴(kuò)增20 s，在72 ℃條件下擴(kuò)增30 s，做5次循環(huán)；在72 ℃條件下擴(kuò)增5 min，最后冷卻至10 ℃. PCR結(jié)束后，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4.216S rDNA測(cè)序數(shù)據(jù)處理

16S rDNA測(cè)序由上海生工公司完成，通過(guò)原始序列數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾，得到3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)處理后高質(zhì)量序列讀數(shù)。再使用Usearch去除預(yù)處理后序列中非擴(kuò)增區(qū)域序列和靶區(qū)域外序列，最后得到3個(gè)樣本(Toluene，Benzoate，Back)剩余序列數(shù)目。通過(guò)OTU(operational taxonomic unit)操作單元分類法將3個(gè)樣本菌種、菌屬的相似性進(jìn)行歸類，用Venn圖來(lái)統(tǒng)計(jì)樣本中共有和獨(dú)有的OTU的數(shù)目，直觀地展現(xiàn)出3個(gè)樣品(Back，Toluene，Benzoate)的OTU數(shù)目組成。

采用Na?ve Bayesian assignment算法對(duì)每條序列在不同層級(jí)水平上計(jì)算其分配到此rank中的概率值，當(dāng)概率值大于0.8時(shí)，此分類結(jié)果可信。同時(shí)基于Bergey’s taxonomy后分為6層，依次為域(domain)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)。最后根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果數(shù)量，統(tǒng)計(jì)在各個(gè)分類層級(jí)水平上的3個(gè)樣品(Back，Toluene，Benzoate)的群落組成。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集菌液中微生物對(duì)甲苯或苯甲酸的降解

在菌液富集期間，甲苯或苯甲酸(電子供體)在硝酸鹽(電子受體)還原條件下完全反應(yīng)時(shí)，若不考慮細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，硝化反應(yīng)過(guò)程化學(xué)計(jì)量方程式如下。

甲苯：

苯甲酸：

在第8 d，向活性菌液中添加相應(yīng)的甲苯(或苯甲酸)和硝酸鹽，而背景對(duì)照菌液中只添加硝酸鹽。在第16 d中，背景對(duì)照菌液中硝酸鹽被消耗約0.46mmol/L之后基本保持變化，但在活性菌液中，甲苯和苯甲酸分別被消耗約0.10 mmol/L，基本被全部降解。在本實(shí)驗(yàn)中，甲苯和苯甲酸的降解率與硝酸鹽的消耗量比值分別為1∶8.7和1∶5.9，這說(shuō)明原甲苯菌液土壤中仍有少量有機(jī)物與硝酸鹽完全反應(yīng)。圖1表明，在活性菌液中，硝酸鹽能夠生成亞硝酸鹽，之后又完全反應(yīng)。在滅活對(duì)照菌液中，底物濃度基本保持不變。在背景對(duì)照和滅活對(duì)照菌液中，沒(méi)有亞硝酸產(chǎn)生。

圖1 富集菌液中的基質(zhì)降解和硝酸根還原過(guò)程Fig.1 Substrate degradation and nitrate-reducing process in enrichment solution

2.2 樣品測(cè)序操作單元分類及菌群多樣性分析

3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)的高通量測(cè)序共得到183 690條高質(zhì)量序列，平均長(zhǎng)度為421.24 bp.以97%相似度劃分，共得到8 382個(gè)OTU，見表1.在焦化土壤富集菌液中，3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)中檢測(cè)得到的序列數(shù)分別為65 216、61 101、57 373.背景對(duì)照樣本中含有3 502個(gè)OTU，降解甲苯和苯甲酸菌液中分別含有2 776個(gè)OTU和2 551個(gè)OTU. 3個(gè)樣品覆蓋率值均為0.96，說(shuō)明絕大部分的樣品基因序列在測(cè)序后被組裝得到,測(cè)序結(jié)果能夠較準(zhǔn)確地反映樣品的生物菌群特性。

香農(nóng)指數(shù)(Shannon index)指數(shù)通常用來(lái)分析微生物樣品的生物菌群多樣性，香農(nóng)指數(shù)越大，說(shuō)明樣品生物多樣性越高[15]。在表1中，由Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可看出，背景對(duì)照指數(shù)均大于降解苯甲酸菌液指數(shù)和降解甲苯溶液指數(shù)。3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)香農(nóng)指數(shù)分別為3.80、3.43、2.91，說(shuō)明降解甲苯和苯甲酸的生物多樣性明顯都比背景對(duì)照低。

表1 微生物群落多樣性指數(shù)Table 1 Microbial community diversity index

在土壤富集菌液中，利用Venn圖對(duì)3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)的OTU進(jìn)行相互歸類比較，如圖2所示，甲苯菌液和背景對(duì)照中OTU共享數(shù)量為161個(gè)，各自獨(dú)有OTU數(shù)分別為2 615和3 344. 甲苯菌液和苯甲酸菌液共享的OTU數(shù)241個(gè)，各自擁有OTU數(shù)分別為2 535和2 310. 苯甲酸菌和背景對(duì)照共有的OTU數(shù)125個(gè)，各自特有的分別為2 426和3 380. 由OTU層面來(lái)看，3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)存在相似的OTU類型較少，表明樣品間主要菌種類型很可能差別較大，同時(shí)相似OTU的不同含量也可能造成菌種比例及菌群結(jié)構(gòu)差異。

圖2 細(xì)菌群落操作單元結(jié)構(gòu)Venn圖Fig.2 Venn plot of bacterial community structure

2.3 細(xì)菌群落組成和菌群結(jié)構(gòu)差異性

2.3.1菌群在門上組成和結(jié)構(gòu)差異的分析

利用16S rRNA宏基因組測(cè)序序列，進(jìn)一步分析微生物群落在門水平上群落結(jié)構(gòu)豐度和菌群組成。3個(gè)土壤樣品(Back，Toluene，Benzoate)的8 382條OTU分屬10個(gè)門，15個(gè)綱，25個(gè)科，34個(gè)目，44個(gè)屬，見圖3.圖3(a)中可觀察到樣品菌門上的分類，其中低于1%的部分合并為other. 3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)中變形菌門(Proteobacteria)占3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)的豐度較大，分別為55.65%、67.21%和62.44%，這主要因?yàn)镻roteobacteria菌能長(zhǎng)期生活在含有大量芳香族有機(jī)物的焦化土壤中[16-17]。在厭氧反硝化富集焦化土壤菌液中，降解甲苯的主要菌門為Proteobacteria、Firmicutes和Deinococcus-thermus，相對(duì)豐度分別為67.21%、22.52%和8.16%，這與文獻(xiàn)研究得出厭氧降解甲苯菌群基本一致[18]，推斷出這三個(gè)菌門的細(xì)菌是富集菌液厭氧反硝化降解甲苯的重要菌群。在圖3(a)中，降解苯甲酸樣本的菌門主要為Proteobacteria、Firmicutes、Ignavibacteria、Deinococcusthermus、Bactercidetes和Actinobacteria，相對(duì)豐度分別為62.44%、7.54%、13.15%、8.89%、4.24%和1.28%，這包括了降解甲苯菌液中主要的菌門種類，這由于苯甲酸和甲苯降解過(guò)程的共代謝模型[19]。其中，從圖3(a)可看出，與背景控制的菌門相比，降解甲苯菌液的三個(gè)菌門中Proteobacteria、Firmicutes和Deinococcus-thermus菌豐度分別增長(zhǎng)了20.77%、142.67%和17.41%，F(xiàn)irmicutes菌的豐度增加量顯著，從而說(shuō)明降解甲苯菌液中菌種的優(yōu)勢(shì)門為Firmicutes.而相較于背景控制菌液，降解苯甲酸菌液樣本中Proteobacteria、Ignavibacteria、Deinococcus-thermus和Bactercidetes菌豐度分別增加了12.20%、8.00%、8.89%和7.61%，但Fimicutes和Actinobacteria菌分別減少了18.75%和60.10%，這說(shuō)明降解苯甲酸的優(yōu)勢(shì)菌門為Proteobacteria.在以甲苯或苯甲酸為碳源的焦化污染土壤富集菌液中，Proteobacteria門菌的相對(duì)豐度都最高，是能夠降解廣泛有機(jī)污染物生物除氮的主要細(xì)菌菌落[20]。3個(gè)樣本(Back，Toluene，Benzoate)中大部分的細(xì)菌群落菌門均已分析(相對(duì)豐度分別為5.24%、2.11%和2.46%的微生物未分類以及未鑒定)。

圖3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布Fig.3 Composition of the bacterial community structure

2.3.2菌群在綱上結(jié)構(gòu)差異的分析

通過(guò)高通量測(cè)序檢測(cè)三個(gè)樣品(Back，Toluene，Benzoate)共得到15種細(xì)菌綱類，將低于1%和未檢測(cè)到的菌群歸于other，剩下主要菌群有12種，見圖3(b).圖3(b)為綱水平上的分類，背景對(duì)照中綱排序前三的菌群依次為α-proteobacteria、β-proteobacteria、Ignavibacteria，相對(duì)豐度分別為20.92%、17.77%、12.15%.降解甲苯土壤菌液中菌群綱類前三排序依次為α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli，相對(duì)豐度分別為38.93%、20.47%、17.32%，是背景對(duì)照土壤中菌群相對(duì)豐度的1.86倍、1.87倍、2.14倍。降解苯甲酸土壤樣本菌液中前三類綱排序?yàn)棣?proteobacteria、Ignavibacteria、γ-proteobacteria，同時(shí)分別相對(duì)豐度為46.10%、13.15%、9.54%，是背景對(duì)照土壤中菌群相對(duì)豐度的2.59倍、1.08倍、0.87倍。其中，α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli是降解甲苯土壤中的優(yōu)勢(shì)綱，而降解苯甲酸土壤中優(yōu)勢(shì)綱為β-proteobacteria.在3個(gè)樣品中Proteobacteria主要包括α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria. α-proteobacteria和β-proteobacteria相對(duì)豐度較高，在缺氧或厭氧條件下，Proteobacteria的α-及β-綱的菌株能夠使苯類物質(zhì)在硝酸鹽條件下發(fā)生還原反應(yīng)[21]，β-proteobacteria經(jīng)常利用有機(jī)物分解產(chǎn)生的氨氣、甲烷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。從圖3(b)中觀察到，α-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli和Deinococci綱是降解苯甲酸和降解甲苯土壤中共同擁有的綱類，其中α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli在甲苯降解菌液中的相對(duì)豐度比苯甲酸降解菌液的分別增加了33.00%、10.93%、10.02%，而降解甲苯土壤菌液中β-proteobacteria和Deinococci的相對(duì)豐度比苯甲酸菌液減少了38.33%和0.73%.這充分說(shuō)明了各類綱在底物不同的條件下，菌種對(duì)菌液環(huán)境的適應(yīng)性不同，各類菌種為了適應(yīng)各自的能源環(huán)境而表現(xiàn)出來(lái)的微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異(相對(duì)豐度分別為5.24%、2.11%和2.46%的微生物未分類以及未鑒定)。

2.3.3菌群在屬上結(jié)構(gòu)差異的分析

為了能夠進(jìn)一步細(xì)化微生物菌群結(jié)構(gòu)的差異性和菌群組成，以菌屬為研究對(duì)象，2個(gè)樣品(Toluene，Benzoate)共檢測(cè)到44種細(xì)菌菌屬。將低于1%和未檢測(cè)到的菌屬歸于other，剩下主要菌屬有16類，如圖4所示。甲苯降解菌液中前三位菌屬相對(duì)豐度排序：Exiguobacterium>Phyllobacterium>Citrobacter，分別占Deinococci、α-proteobacteria、γ-proteobacteria百分比為95.40%、41.70%、48.85%，Exiguobacterium是甲苯降解菌液的優(yōu)勢(shì)菌屬。這充分說(shuō)明在Deinococci綱中，Exiguobacterium菌屬在甲苯降解土壤菌液環(huán)境中生存能力極強(qiáng)[16]。Phyllobacterium和Citrobacter菌屬分別在α-proteobacteria綱和γ-proteobacteria綱中，相比其他菌屬適應(yīng)甲苯降解菌液能力較強(qiáng)。苯甲酸降解菌液菌屬相對(duì)豐度排前三位的依次是：Azoarcus>Ignavibacterium>Truepera，分別占β-proteobacteria、Ignavibacteria、Deinococci百分比為86.96%、100%、99.78%，表明苯甲酸土壤菌液中Azoarcus為優(yōu)勢(shì)菌屬，Azoarcus、Ignavibacterium、Truepera菌屬在各自綱水平群落結(jié)構(gòu)中占主要地位。2個(gè)土壤菌液樣品(Toluene，Benzoate)共同享有的菌屬包括Exiguobacterium、Citrobacter、Truepera、Acinetcbacter、Limnobacter、Pseudomonas，其中Exiguobacterium菌屬在兩種土壤菌液中相對(duì)豐度較高，說(shuō)明Exiguobacterium屬在兩種菌液中能以甲苯或苯甲酸作為能源物質(zhì)，進(jìn)行自身細(xì)胞新陳代謝而增殖。此外，SHIM et al[22]培養(yǎng)Pseudomonas菌在纖維床生物反應(yīng)器中缺氧降解苯系物。Exiguobacterium和Pseudomonas菌在富集海洋沉積物降解BTEX中也能得到[23]。甲苯降解菌液獨(dú)有的微生物菌屬有Phyllobacterium、Aquamicrobium、Thauera、Anaxybacter、Stappia、Alkaliphilusd，而苯甲酸降解菌液獨(dú)有的菌屬為Azoarcus、Ignavibacterium、Moheibacter、Parvibaculum、Lamia，其中Azoarcus是焦化污染土壤中厭氧反硝化降解苯甲酸的最主要菌屬。LI et al[24]等應(yīng)用基于16S rRNA基因的DGGE技術(shù)，甲苯脫氮降解菌中Azoarcus并不顯著，而苯甲酸降解菌液中最佳匹配菌Thauera、Azoarcus和Thauera具有反硝化降解芳烴類有機(jī)物的能力[24]。在焦化土壤中，微生物菌落結(jié)構(gòu)是一個(gè)具有差異的結(jié)構(gòu)，環(huán)境中基質(zhì)的不同導(dǎo)致微生物多樣性也不同。在整個(gè)甲苯或苯甲酸降解過(guò)程中，很可能是好幾種細(xì)菌起重要作用，也可能是許多微生物的共同協(xié)作來(lái)參與反應(yīng)。因此，焦化土壤富集菌液中微生物菌群參與過(guò)程以及降解甲苯或苯甲酸的功能性基因特性需要探究，為厭氧修復(fù)焦化土壤技術(shù)層面增加依據(jù)。

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成Fig.4 Composition of the bacterial community structure at genus level

3 結(jié)論

1) 在富集焦化污染土壤菌液過(guò)程中，微生物降解甲苯或苯甲酸與消耗硝酸鹽的反應(yīng)過(guò)程是同步進(jìn)行的，本實(shí)驗(yàn)甲苯和苯甲酸的降解量與硝酸根的反應(yīng)量實(shí)際比值分別約為1∶8.7和1∶5.9，這個(gè)數(shù)據(jù)和理論計(jì)量學(xué)比率在合理程度上可認(rèn)為相近。

2) 在120 d厭氧脫氮富集焦化污染土壤菌液過(guò)程中，活性菌液微生物降解甲苯和苯甲酸的微生物菌群結(jié)構(gòu)多樣性都比背景對(duì)照樣本中少一些，且兩者之間菌群差異較大。焦化土壤中主要菌門為Proteobacteria，反硝化菌液中降解甲苯的優(yōu)勢(shì)門為Firmicutes，而降解苯甲酸菌液中的優(yōu)勢(shì)門為Proteobacteria.

3) α-proteobacteria、γ-proteobacteria、Bacilli是降解甲苯土壤中的優(yōu)勢(shì)綱，而降解苯甲酸土壤中優(yōu)勢(shì)綱為β-proteobacteria.

4)Exiguobacterium是甲苯降解菌液的優(yōu)勢(shì)菌屬，而苯甲酸土壤菌液中Azoarcus為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為16.53%和40.09%.