曲麗莎，于文文，呂雪芹*，李江華，堵國成，劉龍*

1(江南大學 未來食品中心，江蘇 無錫，214122) 2(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

維生素D(Vitamin D, VD)，被稱為“陽光維生素”，是維持機體健康所必需的一種脂溶性維生素。麥角鈣化醇(ergocalciferol, VD2)和膽鈣化醇(Cholecalciferol, VD3)是VD系列化合物中主要的兩種存在形式[1]。人體皮膚組織內(nèi)含有大量的7-脫氫膽固醇(7-dehydrocholesterol, 7-DHC)，經(jīng)紫外光照射后會轉(zhuǎn)變?yōu)閂D3，該合成途徑也是人體獲得VD最主要的來源。與VD3可在體內(nèi)自主代謝合成不同，VD2在人體內(nèi)無法代謝合成，必須依靠外界的飲食攝取。

VD本身沒有生理活性，只有經(jīng)過羥基化修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问讲拍茉谌梭w內(nèi)發(fā)揮生理作用。如圖1所示，飲食攝取或人體自身合成的VD3由結合蛋白(vitamin D-binding protein, DBP)從血液轉(zhuǎn)運至肝臟，在肝臟中經(jīng)細胞色素P450酶羥基化修飾形成25-羥基維生素D3(25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3)，25(OH)D3是VD在人體內(nèi)的主要循環(huán)方式，其濃度是衡量體內(nèi)VD狀況的標準之一。之后25(OH)D3將由DBP再次運輸至腎臟并修飾轉(zhuǎn)變?yōu)?,25-二羥基維生素D3(calcitriol，1,25(OH)2D3)、24,25-二羥基維生素D3(24,25-hydroxyvitamin D3，24,25(OH)2D3)等活性形式[2]。

VD是骨骼正常生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，人體缺乏VD時會導致佝僂病、骨質(zhì)軟化等疾病[3]。VD不僅能夠促進鈣磷吸收[4]，還能作用于大腦神經(jīng)，預防精神分裂癥、自閉、認知障礙和神經(jīng)退化等疾病[5-8]，同時適當補充VD可有效治療和預防糖尿病[9-10]。此外越來越多的實驗證明,VD在治療免疫性系統(tǒng)疾病、癌癥以及心血管疾病等方面也具有良好的生理作用[11-13]。

圖1 VD活性形式轉(zhuǎn)變示意圖Fig.1 Schematic diagram of VD active form transformation

隨著VD的各種生理活性不斷被發(fā)現(xiàn)，VD的全球市場年需求量也在日益增長。目前工業(yè)化生產(chǎn)VD的主要方法為半化學合成法，即以膽固醇、麥角固醇、豆甾醇、巖藻甾醇以及孕烯醇酮等為底物，經(jīng)過簡單的化學反應生成[14]。反應底物是半化學合成的重要因素之一，如何大量廉價地獲取天然甾醇也是目前工業(yè)化生產(chǎn)VD過程中面臨的挑戰(zhàn)之一。麥角固醇、7-DHC分別是半化學合成VD2及VD3的理想前體，但這些天然甾醇在宿主中的單體含量較少，已漸漸無法滿足當下工業(yè)化合成VD的生產(chǎn)需求。

合成生物學是以系統(tǒng)生物學和代謝工程學的研究為基礎，使用工程化設計思路，將已知或未知的天然生物模塊進行構建串聯(lián)，從而建立全新的人工生物系統(tǒng)。隨著合成生物學的迅猛發(fā)展，越來越多的代謝機理途徑得到闡明，這使得人們可以借助合成生物學在微生物細胞內(nèi)對宿主固有途徑進行調(diào)控，協(xié)調(diào)外源基因表達模塊與內(nèi)源代謝路徑模塊，平衡各模塊之間的代謝流通量，從而在工業(yè)規(guī)模上實現(xiàn)其高效合成。這種新技術不僅可以滿足市場的增長需求，而且綠色環(huán)保，是解決資源可持續(xù)化問題、提高目標代謝物產(chǎn)量的最佳途徑之一。

利用合成生物學技術在微生物體內(nèi)重構代謝途徑是提高產(chǎn)物產(chǎn)量的有效手段。由于提高VD前體甾醇的合成是增加VD得率的關鍵步驟，因此本篇文章著重介紹當前VD前體合成的新興技術與手段，主要包括動態(tài)調(diào)控、亞細胞工程、無細胞系統(tǒng)、定向進化等。

1 VD前體的生物合成進展

1.1 VD前體生物合成途徑

如圖2所示，甾醇在細胞內(nèi)的生物合成途徑可以分為2個部分，即法尼基二焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)合成途徑與后角鯊烯合成途徑[15]。

ERG10：乙酰乙酰輔酶A 硫解酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase)；ERG13：3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) synthase)；HMG1：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)；ERG12:甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase)；ERG8:磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase)；ERG19：甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(mevalonate pyrophosphate decarboxylase)；IDI1：異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl diphosphate isomerase)；ERG20：法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthetase)；ERG1：鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase)；ERG7：羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase)；ERG11：甾醇14α-去甲基化酶(lanosterol 14-alpha-demethylase)；ERG24：C-14甾醇還原酶(C-14 sterol reductase)；ERG25：C-4固醇甲基氧化酶(C-4 methyl sterol oxidase)；ERG26：C-3甾醇脫氫酶(C-3 sterol dehydrogenase)；ERG27：C3-酮基還原酶(3-keto sterol reductase)；ERG2：C-8 甾醇異構酶(C-8 sterol isomerase)；ERG3：甾醇-C5-去飽和酶(sterol C5-desaturase)； ERG4：固醇C-24(28)還原酶(C-24(28) sterol reductase)；ERG5：固醇C-22-去飽和酶(C-22 sterol desaturase)；ERG6：甾醇C-24 甲基轉(zhuǎn)移酶 (Delta(24)-sterol C-methyltransferase)圖2 甾醇代謝合成途徑Fig.2 Sterol metabolic pathway

原核細胞內(nèi)的FPP主要通過2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)途徑代謝合成，而真核生物則是通過甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑合成。真核生物中含有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，有助于關鍵酶(細胞色素P450酶、異源蛋白酶等)的表達，因此選擇真核生物如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等為底盤細胞進行甾醇產(chǎn)量的優(yōu)化調(diào)控更為高效[16]。MVA途徑以乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)為催化底物，經(jīng)多步酶作用合成FPP[17]。MVA途徑是麥角固醇與7-DHC合成的共同代謝途徑，調(diào)控MVA代謝途徑，提高FPP代謝通量是最終實現(xiàn)甾醇的高效合成的首要方法。HMGR (3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，encoding the catalytic domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)和IDI1都是MVA途徑代謝的主要限速酶，增加HMGR與IDI1的表達量能夠顯著提高FPP的產(chǎn)量[18]。KEASLING等在S.cerevisiae中過表達截短的HMGR(tHMGR)，減少了HMG-CoA的積累，進而提高了甲羥戊酸的產(chǎn)量[19]。JIANG等在S.cerevisiae中過表達tHMGR和IDI1，異戊二烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)的合成產(chǎn)量明顯提高[20]。本課題組前期在枯草芽孢桿菌中通過異源表達kdpG基因，引入外源ED途徑，同時替換組成型強啟動子的方式強化MEP途徑中的關鍵酶基因dxs、dxr、fni的表達，增強維生素K2前體異戊二烯焦磷酸IPP的含量，最終使維生素K2的產(chǎn)量提高到32 mg/L[21]。

FPP在角鯊烯合成酶的催化下合成角鯊烯，角鯊烯在酶催化作用下代謝合成麥角固醇。麥角固醇是細胞膜的重要組成成分，決定著結構膜的流動性和滲透性。強化ERG1、ERG4、ERG11等基因的表達最終都會提高麥角固醇的發(fā)酵產(chǎn)量[22]。POLAKOWSKI等[23]提高細胞的酯化能力，進而增加了酵母胞內(nèi)的甾醇濃度。Are2基因編碼甾醇-?；D(zhuǎn)移酶，HE等在S.cerevisiae內(nèi)同時強化表達了ERG4和Are2p基因，麥角固醇的產(chǎn)量最終達到1 707 mg/L[24]。

麥角固醇的合成途徑天然存在于S.cerevisiae內(nèi)[25]，而7-DHC的合成途徑需引入外源基因3β-羥基甾醇-D24還原酶(24-dehydrocholesterol reductase, DHCR24)[26]。麥角固醇代謝途徑是合成7-DHC的最大競爭途徑，抑制或敲除ERG5、ERG6基因可以阻斷內(nèi)源性麥角固醇合成途徑[27]，促進酵母甾醇的積累，從而有利于7-DHC的高效合成。GUO等在家雞中分離鑒定出Gg_DHCR24蛋白，異源表達后7-DHC的產(chǎn)量達到64.1 mg/L，之后組合工程技術優(yōu)化代謝途徑7-DHC的產(chǎn)量達到了1.07 g/L[28]。

1.2 代謝工程調(diào)控甾醇合成途徑

1.2.1 “推-拉-抑制”技術

Acetyl-CoA是碳代謝的關鍵中間體，其供給水平是決定MVA途徑代謝通量的首要因素。增加acetyl-CoA在MVA途徑中的供給效率，是近年來代謝工程的研究熱點。胞質(zhì)內(nèi)的acetyl-CoA是由丙酮酸脫羧化酶(pyruvate decarboxylase，PDC)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALD)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)和acetyl-CoA合成酶(Acetyl-CoA synthase, ACS)等多種酶共同催化作用[29]。乙酰CoA推拉抑制策略是通過代謝工程改造天然MVA途徑和乙酰CoA途徑的常用手段。該策略包括將代謝通量“推”向乙酰CoA的有效產(chǎn)生,即過表達ACS、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(acetoacetyl-CoA thiolase, AACT)或者重構非天然代謝途徑[30]，使得碳代謝通量更多地流向乙酰CoA合成途徑；“拉”動乙酰CoA的有效消耗，即過表達tHMGR、IDI1以及異戊二烯合酶(isoprene synthase, ispS)[31-32]。此外，抑制丙酮酸脫氫酶旁路(pyruvate dehydrogenase，PDH)以及乙醇降解途徑同樣可以顯著提高胞質(zhì)內(nèi)acetyl-CoA含量[33]。LIAN等[34]在S.cerevisiae中過表達ADH2、ALD6、ACS等基因，使得碳代謝通量最大化地流向acetyl-CoA合成途徑，并在此基礎上過表達ACL基因，催化檸檬酸生成acetyl-CoA，最終胞內(nèi)acetyl-CoA的濃度提高了3倍。SU等[35]基于模塊化途徑工程技術在S.cerevisiae內(nèi)調(diào)控優(yōu)化acetyl-CoA 的供給水平，最終7-DHC的產(chǎn)量增加了85.44%。

1.2.2 動態(tài)調(diào)控策略技術

傳統(tǒng)的靜態(tài)調(diào)控雖然可以提高目標代謝物的產(chǎn)量，但蛋白表達量的急劇增加會導致部分蛋白無法正確表達其功能，且會引起代謝失衡、有毒中間代謝物積累及細胞生長受損等問題。動態(tài)調(diào)控是近年來新興的一種代謝工程改造策略。相比于靜態(tài)調(diào)控，動態(tài)調(diào)控能夠響應細胞內(nèi)外環(huán)境的變化，可以在提高產(chǎn)物合成能力的同時動態(tài)協(xié)調(diào)相關代謝網(wǎng)絡的流量分布，從而避免靜態(tài)調(diào)控帶來的問題，因此其在近年來受到了人們的廣泛關注。

生物傳感器是構建動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的關鍵。轉(zhuǎn)錄因子是最具代表性的生物傳感器之一，轉(zhuǎn)錄因子是能夠結合DNA上游特異核苷酸序列并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的一類蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子由DNA結合結構域、鋅指結構域等多個功能域構成，每個區(qū)域在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中都發(fā)揮著關鍵作用。細胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄受到大量轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子對代謝途徑優(yōu)化是動態(tài)調(diào)控策略的經(jīng)典思路。轉(zhuǎn)錄因子Upc2包含一個N末端鋅指結構域和一個C末端配體結合結構域，該結構域可以直接結合麥角固醇以響應胞內(nèi)的麥角固醇濃度，進而調(diào)控麥角固醇的生物合成。當胞內(nèi)的麥角固醇濃度較高時，Upc2與其結合從而停留在細胞核外；當麥角固醇濃度降低時，Upc2與麥角固醇上解離，并轉(zhuǎn)移到細胞核中以激活麥角固醇相關基因的轉(zhuǎn)錄[36]。

天然的生物傳感器由于其內(nèi)源性的特點，在進行表達時會有更好的兼容性。但天然的生物傳感器在后續(xù)應用中存在著明顯的局限性，許多代謝物尚未發(fā)現(xiàn)與之對應的天然生物傳感器，這極大地限制了動態(tài)調(diào)控策略的普適性?；诖耍芯空邆兺ㄟ^結合蛋白質(zhì)工程和生物傳感器技術，創(chuàng)造了一個全新可編程的化學誘導二聚體系統(tǒng)(chemically induced dimerization systems, CIDs)。不同于在已知結構位點的改造，CIDs在蛋白質(zhì)異二聚體復合物的連接處構建小分子結合位點，并在該聚合體上連接3～4個殘基用于與目標配體進行相互作用；之后借助于計算機算法篩選優(yōu)化相容的蛋白質(zhì)支架。FPP是MVA代謝合成途徑中的重要關鍵體， 篩選構建FPP生物傳感器將具有良好應用性。ANUM等[37]選擇FPP作為目標配體，借助于CIDs系統(tǒng)對已有的配體-蛋白結合進行篩選改造，最終得到了響應FPP的生物傳感器。

群體感應系統(tǒng)(quorum-sensing, QS)是動態(tài)調(diào)控策略中另一經(jīng)典思路，該系統(tǒng)能夠較好地平衡細胞生長與代謝產(chǎn)物之間的關系[38]。不同于傳統(tǒng)的人工誘導調(diào)節(jié)，QS能夠通過調(diào)控代謝產(chǎn)物來響應細胞濃度的變化，即細胞濃度達到一定的閥值范圍時，控制代謝途徑的開關才會響應表達[39]。圖3形象展示了QS系統(tǒng)在釀酒酵母細胞內(nèi)的應用。THOMAS等[40]在S.cerevisiae內(nèi)首先以響應芳香氨基酸的啟動子ARO9控制表達α信息素基因，使得細胞濃度與α信息素濃度相關聯(lián)；啟動子FUS1可以響應α信息素，因此外源基因的表達由啟動子FUS1控制，最終構建出適用于S.cerevisiae的QS系統(tǒng)。WILLIAMS等[41]基于QS系統(tǒng)的基礎上，結合RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術開發(fā)了雙向動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。在釀酒酵母細胞中導入AGO1和DCR1基因，當目標代謝產(chǎn)物途徑響應α信息素進行高效表達時，雙鏈發(fā)夾結構的RNA(dsRNA)可以靶向任何mRNA，并對其進行降解，使目標基因沉默。因此通過RNAi干擾對競爭代謝支路進行抑制作用，進而更加高效地實現(xiàn)目標代謝物的合成?；谌后w響應具有不依賴代謝途徑，不需額外添加誘導劑等優(yōu)勢，本課題組前期在枯草芽孢桿菌中利用群體響應系統(tǒng)Phr60-Rap60-Spo0A動態(tài)調(diào)控脂溶性維生素K2的合成，使細胞的生長、有毒代謝物的積累與維生素K2的高效合成形成相對平衡的狀態(tài)，使維生素K2的產(chǎn)量相較于野生菌株產(chǎn)量提高40倍，在15 L生物反應器中，第3天的產(chǎn)量達到200 mg/L[21]。

圖3 動態(tài)調(diào)控Fig.3 Dynamic regulation

1.2.3 亞細胞工程

與原核生物相比，真核生物胞內(nèi)具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細胞器。這些細胞器在微生物生長代謝過程中發(fā)揮著重要作用。亞細胞工程就是對某些特定細胞器進行理性改造，使其能夠更加有利于目的產(chǎn)物的代謝合成。代謝區(qū)室化可以為生物合成途徑提供合適的物理化學環(huán)境、充足的前體物質(zhì)和相應的酶。正如圖4所示的乙酰CoA，其不僅可以在胞質(zhì)內(nèi)生成，還可以在線粒體、過氧化物酶體等多個細胞器中合成[29]。這類細胞器中并沒有天然的MVA途徑存在，因此在其中重構MVA途徑可避免其他支路途徑的競爭，提高代謝合成效率，增加FPP合成來源。線粒體基質(zhì)中氧化還原電位較高，ATP含量豐富，有利于各種生化反應。此外線粒體內(nèi)的A乙酰CoA濃度是胞質(zhì)濃度的20～30倍，可以極大地提高MVA途徑的代謝通量[42]。DANIELLE等[43]在MVA途徑基因N端添加特定的定位氨基酸序列，成功在線粒體內(nèi)重構完整的MVA途徑。LV等[32]以S.cerevisiae為出發(fā)菌株，同時調(diào)控優(yōu)化胞質(zhì)產(chǎn)乙酰CoA途徑和線粒體產(chǎn)乙酰CoA途徑，促進了細胞生長并且提高了發(fā)酵產(chǎn)率。LIU等[44]在S.cerevisiae中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體是儲存角鯊烯的動態(tài)倉庫。利用過氧酶體作為亞細胞間室進行角鯊烯合成，使角鯊烯的發(fā)酵產(chǎn)量(1 312.82 mg/L)相對于親本菌株提高了138倍。通過細胞質(zhì)和過氧化物酶體工程的雙重調(diào)控，角鯊烯發(fā)酵產(chǎn)量進一步提高到1 698.02 mg/L。這表明過氧化物酶體同樣具有成為甾醇類生物合成亞細胞工廠的潛能。

圖4 代謝區(qū)室化Fig.4 Metabolic compartment

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成和折疊的場所，當?shù)鞍妆磉_量急劇增加時，ER無法平衡其蛋白合成與折疊修飾能力，蛋白質(zhì)的合成效率降低，部分蛋白合成后無法折疊修飾，此時需擴張ER的尺寸進而來恢復ER的正常生理功能。ER的尺寸調(diào)節(jié)是通過誘導磷脂合成實現(xiàn)的[45]，ER的擴張不僅為細胞提供了額外的空間來容納結合蛋白，而且還提高了蛋白質(zhì)合成的能力。細胞色素P450是典型定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白酶，強化基因INO2的表達時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)尺寸會明顯擴張，該類蛋白酶的活性也會因此顯著提高。因此對于含有細胞色素P450酶的代謝途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是理想的改造目標。

1.2.4 無細胞系統(tǒng)

通過微生物代謝工程做到生物制品的可持續(xù)、低成本的生產(chǎn)是實現(xiàn)工業(yè)化的必然趨勢。而當前技術存在的常見問題包括有毒中間體或產(chǎn)物的積累、關鍵前體在競爭途徑中的損失、最終產(chǎn)品的回收昂貴等[46]。為了克服這些局限性，無細胞代謝工程應運而生，其無需使用完整的細胞即可進行精確的復雜生物分子合成。通過使用體外純化的酶或粗裂解物制備的催化蛋白集合體來擴展傳統(tǒng)生物工程模型的范圍，以生產(chǎn)目標產(chǎn)物[47]。圖5簡單介紹了傳統(tǒng)代謝工程和無細脆代謝工程之間的差別。由于已知每種酶組分的濃度和活性，此系統(tǒng)可以精確控制反應條件和途徑通量。研究表明，通過無細胞系統(tǒng)可提高MVA途徑中間體和目的產(chǎn)物的合成。RODRIGUEZ等[48]利用無細胞代謝工程對MVA途徑進行改造，同時對酶底物和產(chǎn)物進行及時回收，能夠生產(chǎn)40 g/L的DMAPP和IPP。

圖5 無細胞系統(tǒng)Fig.5 Cell-free system

從生物制造的角度來看，無細胞系統(tǒng)將細胞生長與代謝產(chǎn)物生產(chǎn)分開，并將所有碳通量轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物上，可以實現(xiàn)更高的產(chǎn)率和回收率，并且更容易控制反應條件。但是，對于一個需要大量酶參與反應的途徑來說，利用無細胞系統(tǒng)成本較高，輔因子和酶的再生也是一個不可忽視的挑戰(zhàn)。另外，目前體外系統(tǒng)的成本遠超體內(nèi)方法的成本，限制了規(guī)模的擴大，因此大多數(shù)無細胞系統(tǒng)尚未應用在工業(yè)化生產(chǎn)上。

1.2.5 定向進化

定向進化是改善微生物性能的有效方法之一，旨在篩選符合預期的正向突變體。定向進化首先需建立基因突變庫，之后結合與高通量篩選方法快速提升蛋白的特定性質(zhì)，是目前最為常用的蛋白質(zhì)設計改造策略[49]?；蛲蛔儙斓臉嫿ㄊ侄沃饕S機突變、半理性設計和DNA改組等。易錯PCR是目前最常用的隨機突變方法之一，其通過改變PCR反應條件，降低DNA聚合酶的保真性，從而提高PCR反應的突變率，使錯誤的堿基以一定的頻率隨機地摻入到擴增的基因產(chǎn)物中，得到DNA突變文庫；隨后結合高通量篩選方法篩選出符合預期目標的突變基因[50]。IDI是甾醇代謝途徑中的關鍵限速酶之一，天然的IDI酶活性低，半衰期短，底物親和力弱。CHEN等[51]通過易錯PCR以及組合位點特異性飽和誘變，篩選得到正向突變體，突變體IDI的Km比親本IDI的Km降低了10%，Kcat比原IDI提高了28%。

相比于易錯PCR的體外建庫，ICE(Invivocontinuous evolution)是一種應用于真核生物體內(nèi)的定向進化策略。該策略利用酵母細胞中天然存在的Ty1轉(zhuǎn)座子，擴展酵母體內(nèi)的誘變系統(tǒng)。將需進化的目標基因克隆至可誘導的Ty1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基因組中，之后逆轉(zhuǎn)錄酶將Ty1基因組以非高保真形式逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后重新整合至基因組中。CROOK等[52]以S.cerevisiaeBY4741(Δrrm3)為出發(fā)菌株，基于ICE技術以木糖代謝途徑作為進化目標，發(fā)現(xiàn)全局代謝途徑進化的最適突變體并非該途徑中單個酶最佳突變體的簡單疊加。

隨機突變的局限性在于所需的突變文庫較大，并且產(chǎn)生的絕大多數(shù)突變體不符合預期性能或性能不佳。而半理性設計可以在人工選擇的特定位置或區(qū)域內(nèi)進行隨機突變，可以大大縮小突變文庫的容量，更易于篩選。FISCHER等[53]對ERG20進行同源模建，發(fā)現(xiàn)第197位的賴氨酸(Lys)是關鍵活性位點，之后以代謝物香葉醇產(chǎn)量作為酶活的間接表征方法，對該位點進行了一系列的定點突變，最終香葉醇的發(fā)酵產(chǎn)量提高約10～20倍，間接證明了突變后的ERG20酶活的顯著提高。

與ICE策略類似，EvolvR系統(tǒng)可以實現(xiàn)胞內(nèi)的定點突變[54]。該系統(tǒng)包含一個含有導向序列(gRNA)的質(zhì)粒，改造后的enCas9蛋白(改造后其與非特異性DNA的親和力降低)，以及與enCas9蛋白融合表達的非高保真DNA聚合酶。當gRNA引導enCas9-DNA聚合酶融合蛋白至基因組上的靶向位點時，enCas9蛋白與靶基因結合使DNA雙鏈斷裂，然后非高保真DNA聚合酶對切口進行靶向突變。EvolvR可以同時對多個靶向基因進行定點突變，且在酵母細胞中具有傳代時間短、細胞生長繁殖快速等優(yōu)勢。EvolvR技術為高等真核生物體內(nèi)定向突變提供了一個高效的平臺，但該技術目前仍存在一定的缺陷性，即胞內(nèi)會存在游離的非高保真DNA聚合酶對整個基因組進行低概率的突變，因此距離實現(xiàn)完全定向的突變?nèi)跃哂幸欢ǖ木嚯x。

定向進化是當前備受矚目的研究熱點領域。通過對蛋白質(zhì)進行多輪突變、表達和篩選，引導蛋白質(zhì)的性能朝著預期方向進化，進而大幅縮短蛋白質(zhì)進化的過程[55]。但定向進化存在的最大挑戰(zhàn)即是如何建立適宜高效的篩選方法，目前較為普遍的篩選方法是選擇適合的生物傳感器， 并以熒光基因表征突變結果。但如前文所述，許多代謝物目前仍未有與之響應的生物傳感器，無法結合高通量篩選技術，這也成為定向進化技術提高應用普適性的難題之一。

2 光化學合成VD

VD是由關鍵前體甾醇經(jīng)過光化學開環(huán)反應產(chǎn)生的。VD的光合作用是一個由多條異構化反應組成的復雜分支網(wǎng)絡。

麥角固醇轉(zhuǎn)化為VD2的過程中，影響VD2的轉(zhuǎn)化率關鍵在于光源的選擇和光轉(zhuǎn)化器構造。目前國內(nèi)光源的選擇一般選用低壓和高壓汞燈兩種。在VD2的光化學反應中波長的選擇很重要。275～300 nm波長范圍內(nèi)，280～284 nm的紫外光有利于生成VD2，短于280 nm的光易于生成速甾醇，而長于284 nm的光容易生成光甾醇，VD2過度照射，過度輻射還會生成毒甾醇等物質(zhì)[56]，因此VD2的光轉(zhuǎn)化中熒光燈的波長范圍要求極其嚴格。圖6展示了VD在光照條件下的像話轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，波長為283 nm的低壓汞蒸氣紫外熒光燈照射麥角固醇，轉(zhuǎn)化效果最佳，麥角固醇轉(zhuǎn)化率50%以上，VD2收率在70%以上[57]。

圖6 VD的光化學反應Fig.6 Photochemical reaction of VD

7-DHC則會被290～315 nm波長的光子異構化為VD3，這與紫外線B (UVB)的電磁波譜范圍相對應。FUSEO等提出利用連續(xù)微流系統(tǒng)合成VD3[58]，與傳統(tǒng)的兩步法合成VD3不同，該方法在微反應器中可以同時進行光反應和熱反應。7-DHC在反應器中光異構化后轉(zhuǎn)化為維生素原D3，維生素原D3繼續(xù)熱異構化轉(zhuǎn)化為VD3。相比于傳統(tǒng)光合成法，該方法收率高(HPLC-UV:60%，分離率:32%)，操作簡便且無需純化中間產(chǎn)物維生素原D3，具有良好的工業(yè)應用價值。

3 展望

隨著人們逐漸意識到VD對于維持機體健康的重要意義，其全球年市場需求量也因此持續(xù)增加，但關鍵前體甾醇的供給不足卻成為限制VD產(chǎn)能擴大的主要因素之一[59-60]。隨著合成生物學的發(fā)展，在細胞內(nèi)調(diào)控重構甾醇代謝途徑，利用微生物發(fā)酵的方式制備甾醇成為解決甾醇可持續(xù)平穩(wěn)供給的有效技術之一。

本文著重從推-拉-抑制、動態(tài)調(diào)控、亞細胞工程、無細胞系統(tǒng)、定向進化等方面闡述了代謝工程技術在甾醇代謝調(diào)控領域的研究應用。然而這些方法雖能夠顯著地提高甾醇代謝途徑的催化效率與產(chǎn)量，但仍有些許方面值得進一步研究與探索：

(1)如何高效實現(xiàn)酶的催化活性？

酶的豐度和活性共同決定了酶的催化效率，過表達基因增加酶的豐度雖然在一定程度上可以提高酶的催化效率，但當豐度達到一定閾值后，酶的催化活性卻無法繼續(xù)提高，其主要因素之一就是忽視了輔因子在代謝途徑中的關鍵作用[61]。MVA途徑代謝過程中需要NADPH、ATP等輔因子的參與[62]，因此在提高酶豐度的同時需增加NADPH、ATP等輔因子的供給。調(diào)控NADH激酶、NADP+依賴型脫氫酶增強NADPH合成途徑，重構、替換消耗NADPH的支路代謝途徑，使得NADPH等輔因子最大化地流向MVA代謝途徑。輔因子的相對平衡是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要條件之一，而胞內(nèi)全局的輔因子調(diào)控則需要對輔因子的合成、分布、運輸和調(diào)節(jié)機制完全了解。

(2)如何實現(xiàn)甾醇代謝途徑的整體定向進化？

定向進化可以改善細胞魯棒性，優(yōu)化細胞性能。然而目前定向進化主要集中于 “點”的進化，即對某一特定酶的改造。但代謝途徑的催化效率并非是各種酶的簡單疊加，每個“點”在整個代謝途徑中需要的是最適的催化效率而非最高的催化效率。甾醇合成途徑包含MVA途徑、后角鯊烯途徑等，涉及到多種蛋白酶，且許多中間代謝物沒有與之特異響應的生物傳感器，無法建立合適的高通量篩選方法。ICE與CIDs策略的交叉結合將成為解決這一難題的突破口，ICE策略有望實現(xiàn)甾醇代謝途徑的全局性進化，而CIDs策略則可以計算、模擬、構建出非天然的生物傳感器，建立高效、簡便的高通量篩選方案。

(3)如何真正實現(xiàn)從頭合成VD？

目前工業(yè)化制備VD的方法是以甾醇為前體，再經(jīng)過化學合成得到VD。如何在細胞內(nèi)真正實現(xiàn)從頭合成VD將會是未來研究的熱點與難點，其關鍵在于是否能夠鑒定或人工設計出特定的酶來實現(xiàn)光化學合成這一步驟的功能[63]。酶工程是一種具有針對性的策略，借助蛋白質(zhì)晶體結構和計算機模擬，酶工程可以提高酶的特異性和效率，甚至為特定的反應創(chuàng)造非天然的酶[64]。隨著結構生物學的發(fā)展，越來越多的催化酶晶體結構得到了解析，這為鑒定未知酶、構建非天然酶提供了可行性基礎。